【摘要】：副流感病毒3型(parainfluenza virus type 3,PIV3)屬于副粘病毒科呼吸道病毒屬,是囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒,是引起人和動(dòng)物呼吸道疾病的重要病原,包括:人副流感病毒3型(Human parainfluenza virus type 3,HPIV3)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)。目前國內(nèi)外對(duì)HPIV3與BPIV3的研究報(bào)道較為廣泛,但PIV3在羊群中的感染情況在國內(nèi)外都鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病山羊中分離出一株新的PIV3病毒,命名為為山羊副流感病毒3型(Caprine parainfluenza virus 3,CPIV3)JS2013。因此為監(jiān)測(cè)該病在羊群中的流行情況,急需建立一種病原學(xué)及血清學(xué)檢測(cè)方法,為開展流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)。PIV3基因組至少編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白,即NP、P、M、F、HN和L蛋白,其中HN蛋白和F蛋白是副流感病毒3型的主要保護(hù)性抗原。HN蛋白存在至少6個(gè)抗原表位,其N端具有強(qiáng)烈的疏水性,從而使HN蛋白能夠牢固地嵌入病毒囊膜的雙層質(zhì)膜內(nèi),3個(gè)中和性抗原表位均存在于其中。因此本研究利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng),成功表達(dá)PIV3 JS2013重組蛋白His-HN,并制備出針對(duì)CPIV3 HN的單克隆抗體,以期為副流感病毒3型診斷方法的建立和HN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括:1、CPIV3 JS2013 HN基因片段克隆與表達(dá)參考Gen Bank中發(fā)表的牛副流感病毒3型(BPIV3)內(nèi)蒙09毒株(NM09)全基因組序列(Gen Bank登錄號(hào):JQ063064),設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物擴(kuò)增山羊副流感病毒3型(CPIV3)JS2013株HN基因部分序列,將擴(kuò)增得到的基因進(jìn)行測(cè)序,比對(duì)分析其與已報(bào)道HPIV3、BPIV3的序列同源性最高分別為74.3%、79.8%。進(jìn)化分析表明JS2013株并不屬于HPIV3與BPIV3,形成一個(gè)獨(dú)立的分支。將HN基因片段克隆至原核表達(dá)載體p ET-32a(+),獲得原核重組質(zhì)粒p ET-32a-HN。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)菌株中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過SDS-PAGE與His抗體western blot試驗(yàn)分析表明,重組蛋白His-HN誘導(dǎo)表達(dá)成功,并以包涵體形式存在,大小約為46 ku。Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備的高免血清能夠與重組蛋白反應(yīng);病毒接種MDBK細(xì)胞后,間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)表明其多克隆抗體與病毒產(chǎn)生特異性熒光反應(yīng),表明該重組蛋白具有很好的免疫原性和反應(yīng)原性。2、CPIV3 JS2013 HN基因單克隆抗體的制備與鑒定用純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠,制備鼠抗His-HN蛋白的單克隆抗體。按照常規(guī)方法制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合,用間接ELISA篩選陽性克隆,采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,經(jīng)過3次亞克隆后篩選出3株能夠穩(wěn)定分泌抗His-HN蛋白的單克隆抗體,將其分別命名為1F8、2D5、4A7。其細(xì)胞培養(yǎng)上清和小鼠腹水ELISA效價(jià)分別為29、28、28和106、106、105。這三株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的Ig亞型均為Ig G2b,輕鏈類型為κ。Western blot試驗(yàn)驗(yàn)證三株單克隆抗體與His-HN蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng);IFA與Dot-ELISA試驗(yàn)表明三株單克隆抗體均能夠特異性識(shí)別CPIV3 JS2013株。三株單抗的研制成功為建立敏感性高、特異性強(qiáng)的CPIV3抗原診斷方法打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Parainfluenza virus type 3 (PIV3) belongs to the genus Paramyxovirus of the family Paramyxoviridae. It is a single-stranded negative-stranded RNA virus of the capsule. It is an important pathogen causing respiratory diseases in humans and animals, including human parainfluenza virus type 3 (HPIV3) and bovine parainfluenza virus type 3 (Bovine parainfluenza virus type 3). HPIV3 and BPIV3 have been extensively studied at home and abroad, but the infection of PIV3 in goats is rarely reported at home and abroad. A new PIV3 virus named Caprine parainfluenza virus 3 (CPIV3) JS2013 was isolated from infected goats in our laboratory. In order to provide evidence for epidemiological investigation, it is urgent to establish an etiological and serological method for the detection of the disease in sheep. The PIV3 genome encodes at least six structural proteins, namely, NP, P, M, F, HN and L proteins. HN and F proteins are the main protective antigens of parainfluenza virus type 3. HN proteins have at least six epitopes. The N-terminal of the recombinant protein was strongly hydrophobic, so that the HN protein could be firmly embedded in the bilayer plasma membrane of the virus envelope. Three neutralizing antigen epitopes were found in the bilayer plasma membrane. The main research contents include: 1. Cloning and expression of CPIV3 JS2013 HN gene fragment reference Gen Bank published bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) Inner Mongolia 09 strain (NM09) whole genome sequence (Gen Bank login number: JQ063064), design a pair of specificity. The partial sequence of HN gene of JS2013 strain of goat parainfluenza virus type 3 (CPIV3) was amplified by primers. The amplified HN gene was sequenced and compared with HPIV3 and BPIV3. The highest sequence homology was 74.3% and 79.8% respectively. Evolutionary analysis showed that JS2013 strain did not belong to HPIV3 and BPIV3, forming an independent branch. The recombinant plasmid P ET-32a-HN was obtained from the prokaryotic expression vector p ET-32a (+). The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) susceptible strain and expressed by IPTG. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the recombinant protein His-HN was successfully induced and existed as an inclusion body, about 46 ku.Wester. The immunogenicity of the recombinant protein against BALB/c mice was confirmed by n-blot assay. The indirect immunofluorescence assay (IFA) showed that the polyclonal antibody of the recombinant protein could react with the recombinant protein. 2. CPIV3 JS2013 HN To prepare and identify monoclonal antibodies, BALB/c mice were immunized with purified recombinant protein to prepare monoclonal antibodies against his-HN protein. SP2/0 myeloma cells and mouse spleen cells were fused by conventional methods. Positive clones were screened by indirect ELISA, subcloned by limited dilution method, and screened after three subclones. Three monoclonal antibodies secreting His-HN protein stably were identified as 1F8, 2D5 and 4A7. The ELISA titers of the supernatants and ascites of mice were 29, 28, 28 and 106, 106, 105, respectively. The Ig subtypes of the monoclonal antibodies secreted by the three hybridoma cells were all Ig G2b, and the light chain type was kappa. Western blot test confirmed that the three monoclonal antibodies were monoclonal antibodies. The results of IFA and Dot-ELISA showed that all three monoclonal antibodies could specifically recognize CPIV3 JS2013 strains. The successful preparation of three monoclonal antibodies laid a foundation for the establishment of a highly sensitive and specific diagnostic method for CPIV3 antigen.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2234419