【摘要】：傳染性支氣管炎(infectious bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病,給養(yǎng)雞業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)30年代,Massachusetts型IBV被分離鑒定以來,世界各地陸續(xù)分離得到了不同血清型的IBV,且各個血清型間交叉反應(yīng)小,甚至沒有明顯的交叉反應(yīng),給IB的防制帶來了巨大的困難。目前,LX4型IBV毒株已在世界多個國家廣泛流行,對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。我國目前廣泛應(yīng)用的Mass型疫苗不能對LX4型IBV提供有效的保護(hù),免疫雞群體感染LX4型病毒后,體內(nèi)仍能分離到LX4型IBV。因此,開發(fā)出更為安全高效的新型IBV疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急。為了研發(fā)針對LX4型IBV的新型疫苗,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota疫苗株為載體,通過反向遺傳技術(shù),構(gòu)建獲得了表達(dá)LX4型IBV流行株ck/CH/LDL/091022 S1蛋白的重組病毒,命名為rLaSota-S1。生長動力學(xué)結(jié)果顯示,r LaSota-S1與親本病毒LaSota在雞胚中生長模式相似,表明IBV S1的插入不明顯影響載體病毒的復(fù)制。經(jīng)測定,r LaSota-S1的最小致死量致死雞胚的平均時間(Mean death time,MDT)為165.3h,1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(Intracerebral pathogenicity index,ICPI)為0,而LaSota的MDT為100h,ICPI為0.19,這表明IBV S1的插入進(jìn)一步致弱了LaSota的毒力。間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)以及Western Blot證實(shí)S1蛋白能夠在r LaSota-S1感染的雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)中穩(wěn)定表達(dá)并包裝至病毒粒子中。為了評價rLaSota-S1的免疫保護(hù)效力,用rLaSota-S1和LaSota免疫SPF雞,每周采血分離血清。HI試驗(yàn)結(jié)果表明rLaSota-S1與LaSota均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對NDV的HI抗體。ELISA試驗(yàn)結(jié)果證明rLaSota-S1能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對IBV的特異性抗體。免疫后21天分別用ck/CH/LHLJ/1/06型NDV和ck/CH/LDL/091022型IBV強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊。結(jié)果顯示rLaSota-S1和LaSota免疫組用NDV攻擊后沒有出現(xiàn)任何臨床癥狀,存活率為100%,對照組雞在攻毒后第四天全部死亡。攻毒后第4天rLaSota-S1和LaSota免疫組呼吸道排毒率均為10%,攻毒后第8天后沒有檢測到排毒。rLaSota-S1免疫組及對照組用IBV強(qiáng)毒攻擊后,定期采集喉頭拭子,通過real-time RT-PCR檢測拭子中的IBV RNA,r LaSota-S1免疫組的呼吸道排毒率分別為80%、50%、33.3%和16.7%。而對照組的呼吸道排毒率分別為100%、66.7%、66.7%和33.3%。結(jié)果表明,和對照相比,免疫組呼吸道排毒率顯著降低。rLaSota-S1免疫組死亡率為40%,而對照組的死亡率高達(dá)70%。由于一次免疫效果并不理想,所以本試驗(yàn)對免疫程序進(jìn)行了調(diào)整,在首次免疫2周后以相同劑量加強(qiáng)免疫,并每周對雞進(jìn)行采血,通過流式細(xì)胞儀對外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例進(jìn)行分析,結(jié)果表明,免疫雞只的CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例顯著高于對照組,并且在加強(qiáng)免疫后顯著升高,說明r LaSota-S1能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示,加強(qiáng)免疫后IBV抗體水平顯著升高。加強(qiáng)免疫一周后用IBV強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊,攻毒后定期采集攻毒雞的喉頭拭子,通過real-time RT-PCR檢測拭子中的病毒載量,結(jié)果顯示,加強(qiáng)免疫后,雞只呼吸道排毒率分別為66.7%、35.7%、14.3%和7.1%,遠(yuǎn)低于對照組。攻毒后第5天對雞進(jìn)行捕殺,采集組織樣品,通過real-time RT-PCR檢測組織中的病毒載量,結(jié)果表明,加強(qiáng)免疫后,組織中病毒載量明顯低于對照組。上述結(jié)果表明,rLa Sota-S1加強(qiáng)免疫后,對IBV強(qiáng)毒株的攻擊產(chǎn)生的保護(hù)效果相比一次免疫組顯著提高,臨床保護(hù)率可達(dá)到93.3%。
[Abstract]:Infectious bronchitis (IB) is an acute, highly contagious avian infectious disease caused by infectious bronchitis virus (IBV), which has caused great economic losses to the chicken industry. Since the 1930s, Massachusetts IBV has been isolated and identified worldwide. At present, LX4 IBV strain has been widely prevalent in many countries in the world, causing great losses to poultry industry. Mass vaccine widely used in China can not provide LX4 IBV. In order to develop a new type of vaccine against LX4 IBV, the LaSota vaccine strain of Newcastle Disease Virus (NDV) was used as the carrier in this study, and the vaccine strain was retrograde. The recombinant virus expressing the protein of ck/CH/LDL/091022 S1 of LX4 IBV epidemic strain was constructed and named rLaSota-S1. The results of growth kinetics showed that the growth pattern of rLaSota-S1 was similar to that of its parent virus LaSota in chicken embryos, suggesting that the insertion of IBV S1 did not significantly affect the replication of the vector virus. Mean death time (MDT) was 165.3 hours, the intracerebral pathogenicity index (ICPI) was 0 in 1-day-old chickens, while the MDT and ICPI of LaSota were 100 hours and 0.19 respectively, indicating that the insertion of IBV S1 further weakened the virulence of LaSota. Tern Blot confirmed that S1 protein could be stably expressed in Chicken embryo fibroblast (CEF) infected with R LaSota-S1 and packaged into virus particles. To evaluate the immunoprotective effect of rLaSota-S1, SPF chickens were immunized with rLaSota-S1 and LaSota, and serum samples were collected weekly. HI test results showed that both rLaSota-S1 and LaSota could induce serum isolation. The results of ELISA showed that rLaSota-S1 could induce the production of specific antibodies against IBV. On the 21st day after immunization, the mice were attacked with strong IBV strains of ck/CH/LHLJ/1/06 and ck/CH/LDL/091022 respectively. The survival rate was 100%. All the chickens in the control group died on the fourth day. The respiratory tract detoxification rate was 10% in the rLaSota-S1 and LaSota immune groups on the fourth day after the attack, and no detoxification was detected on the eighth day after the attack. Respiratory detoxification rates were 80%, 50%, 33.3% and 16.7% in the NA, R LaSota-S1 immunized group, respectively. Respiratory detoxification rates were 100%, 66.7%, 66.7% and 33.3% in the control group, respectively. Respiratory detoxification rates were significantly lower in the immunized group than those in the control group. The mortality rates in the rLaSota-S1 immunized group were 40% and 70% in the control group, respectively. The results were not satisfactory, so the immunization program was adjusted. After the first immunization for two weeks, the immunization was strengthened with the same dose, and the blood samples were collected weekly. The proportion of peripheral blood T lymphocyte subsets was analyzed by flow cytometry. The results showed that the proportion of CD3 + CD4 + T lymphocyte and CD3 + CD8 + T lymphocyte in immunized chickens was significant. The results of ELISA showed that the level of IBV antibody increased significantly after immunization. After one week of immunization, the throat swabs of the chickens were collected regularly and tested by real-time RT-PCR. The virus load in the swabs was measured. The results showed that the virus load of the chickens was significantly lower than that of the control group. The virus load in the tissues was detected by real-time RT-PCR after 5 days of inoculation. The results showed that the protective effect of rLa Sota-S1 on IBV virulent strains was significantly higher than that of the primary immunization group, and the clinical protective rate was 93.3%.
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：2234136