發(fā)布時間：2018-09-07 12:41

【摘要】：體細(xì)胞核移植技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個研究領(lǐng)域具有越來越重要的意義,但核移植效率低限制了其發(fā)展。目前研究人員普遍認(rèn)為,核移植效率低主要是由于供體細(xì)胞核在卵母細(xì)胞中的重編程不完全造成的。而供體細(xì)胞DNA甲基化重編程異常是主要原因之一。本研究以綿羊卵丘細(xì)胞為供體細(xì)胞,擬通過添加DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine,探討其對綿羊卵丘細(xì)胞生物學(xué)特性、核移植重構(gòu)胚發(fā)育及對胚胎甲基化水平的影響,嘗試建立一種既不影響體細(xì)胞生物學(xué)特性,又可降低供體細(xì)胞細(xì)胞核的甲基化狀態(tài)方法,從而提供一種提高體細(xì)胞核移植效率的有效途徑。試驗(yàn)中使用不同濃度(0、2.5、5、10 nmol/L)的Zebularine處理綿羊卵丘細(xì)胞12 h,研究不同處理對綿羊卵丘細(xì)胞的存活率、染色體倍性、細(xì)胞周期、DNA甲基化水平、DNMT1基因表達(dá)水平、核移植胚胎發(fā)育能力的影響。同時,使用間接免疫熒光染色法檢測了5nmol/L Zebularine處理綿羊卵丘細(xì)胞12 h后對核移植胚胎不同發(fā)育時期DNA甲基化水平的影響。結(jié)果顯示:(1)經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Zebularine(2.5-10 nmol/L)處理后的卵丘細(xì)胞存活率與未經(jīng)過處理的對照組相比沒有顯著差異(P0.05);(2)采用常規(guī)染色體核型分析發(fā)現(xiàn),不同濃度Zebularine處理組與對照組的細(xì)胞染色體整二倍體比例(96.11%、96.53%、95.13%、96.77%)均沒有顯著差異(P0.05);(3)通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,結(jié)果顯示:綿羊卵丘細(xì)胞經(jīng)不同濃度Zebularine處理12 h后,G0/G1的細(xì)胞比例呈逐漸上升趨勢,S期細(xì)胞比例均呈逐漸下降的趨勢,但與對照組之間均沒有顯著差異(P0.05);(4)使用間接免疫熒光染色法檢測DNA甲基化水平,卵丘細(xì)胞DNA甲基化水平隨著Zebularine處理濃度的升高而降低,其中5、10 nmol/L處理組DNA甲基化水平顯著顯著低于對照組(P0.05),但兩處理組間沒有顯著差異(P0.05);(5)通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn):卵丘中Dnmt1基因表達(dá)水平隨著Zebularine處理濃度的升高而降低,其中5、10 nmol/L處理組Dnmt1基因表達(dá)水平顯著低于對照組(P0.05),且10 nmol/L處理組顯著低于5nmol/L處理組(P0.05);(6)綿羊卵丘細(xì)胞經(jīng)不同濃度Zebularine處理12h后進(jìn)行核移植,結(jié)果顯示:Zebularine各處理組與對照組(0 nmol/L)間核移植胚胎的卵裂率差異均不顯著(P0.05);5 nmol/L Zebularine處理組桑椹胚率顯著高于對照組(P0.05),與其他各組間差異不顯著(P0.05)。5 nmol/L Zebularine處理組囊胚率顯著高于對照組及其他Zebularine處理組(P0.05)。(7)使用間接免疫熒光染色法檢測5 nmol/L Zebularine處理綿羊卵丘細(xì)胞12 h后對核移植胚胎DNA甲基化水平的影響,結(jié)果顯示:SCNT-Zebularine組胚胎DNA甲基化水平變化趨勢與體外受精組、核移植對照組胚胎類似,并且不同發(fā)育時期胚胎DNA甲基化水平SCNT-Zebularine組均低于核移植對照組胚胎,其中2-細(xì)胞與8-細(xì)胞期顯著降低(P0.05),但SCNT-Zebularine組胚胎DNA甲基化水平仍高于相應(yīng)時期的體外受精胚胎(P0.05)。綜上所述,綿羊卵丘細(xì)胞經(jīng)過2.5、5、10 nmol/L Zebularine處理12h后,對存活率、染色體倍性、細(xì)胞周期均沒有顯著影響;5、10 nmol/L Zebularine處理12 h后可顯著降低其DNA甲基化水平和Dnmt1基因的表達(dá)水平,且5 nmol/L Zebularine組可以顯著提高核移植胚胎的發(fā)育效率,降低核移植胚胎的DNA甲基化水平。
[Abstract]:Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is becoming more and more important in many fields, such as biology and medicine. However, the low efficiency of SCNT limits its development. Abnormality is one of the main causes. In this study, sheep cumulus cells were used as donor cells to investigate the biological characteristics of sheep cumulus cells, the effects of Zebularine on the development of reconstructed embryos and the level of embryo methylation after nuclear transfer, and try to establish a new method that does not affect the biological characteristics of somatic cells, but also reduces the level of embryo methylation. Low donor cell nucleus methylation provides an effective way to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer. In this experiment, sheep cumulus cells were treated with Zebularine at different concentrations (0,2.5,5,10 nmol/L) for 12 hours to study the survival rate, chromosome ploidy, cell cycle and DNA methylation water of sheep cumulus cells under different treatments. Meanwhile, the effects of 5 nmol/L Zebularine on DNA methylation at different developmental stages of nuclear transfer embryos were examined by indirect immunofluorescence staining. There was no significant difference in the survival rate of cumulus cells between the treated and untreated control groups (P 0.05); (2) There was no significant difference in the percentage of chromosome aneuploidy (96.11%, 96.53%, 95.13%, 96.77%) between Zebularine treated and untreated control groups (P 0.05); (3) There was no significant difference in the percentage of chromosome aneuploidy (96.11%, 96.53%, 95.13%, 96.77%) between Zebularine treated and untreated control groups (P 0. The results showed that after 12 hours of Zebularine treatment, the proportion of G0/G1 cells increased gradually and that of S-phase cells decreased gradually, but there was no significant difference between the control group and the control group (P 0.05); (4) DNA methylation level was detected by indirect immunofluorescence staining. Methylation level decreased with the increase of Zebularine treatment concentration, and DNA methylation level in 5,10 nmol/L treatment group was significantly lower than that in control group (P 0.05), but there was no significant difference between the two treatment groups (P 0.05); (5) Real-time fluorescence quantitative PCR detection showed that Dnmt1 gene expression level in cumulus increased with the increase of Zebularine treatment concentration. The expression level of Dnmt1 gene in 5,10 nmol/L treatment group was significantly lower than that in control group (P 0.05), and 10 nmol/L treatment group was significantly lower than that in 5 nmol/L treatment group (P 0.05); (6) Sheep cumulus cells were treated with different concentrations of Zebularine for 12 hours after nuclear transfer, the results showed that: Zebularine treatment group and control group (0 nmol/L) between the nuclear transfer embryos. The blastocyst rate of 5 nmol/L Zebularine treatment group was significantly higher than that of control group (P 0.05). The blastocyst rate of 5 nmol/L Zebularine treatment group was significantly higher than that of control group and other Zebularine treatment groups (P 0.05). The results showed that the changes of DNA methylation level in SCNT-Zebularine group were similar to those in IVF group and nuclear transfer control group, and the levels of DNA methylation in SCNT-Zebularine group were lower than those in nuclear transfer control group at different developmental stages. The DNA methylation level of SCNT-Zebularine group embryos was still higher than that of in vitro fertilized embryos (P 0.05). In conclusion, the cumulus cells treated with 2.5, 5, 10 nmol/L Zebularine for 12 hours had no significant effect on survival rate, chromosome ploidy and cell cycle. DNA methylation level and Dnmt1 gene expression level were significantly decreased after 12 hours of NE treatment, and the 5 nmol/L Zebularine group could significantly improve the development efficiency of nuclear transfer embryos and reduce the DNA methylation level of nuclear transfer embryos.
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 茫烈;邵華;王鳳武;旭日干;;卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞解離對小鼠卵子體外成熟及受精的影響[J];畜牧與飼料科學(xué);2007年04期

2 李戰(zhàn)彪;宋振華;張攀;張志鵬;潘慶杰;;顆粒細(xì)胞或卵丘細(xì)胞提高小鼠未成熟卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂能力的研究[J];青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年01期

3 張曉華,朱增娟,袁水橋,李東全,羅光彬;卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中的作用[J];黃牛雜志;2005年03期

4 王滇;張春燕;劉松柏;楊利國;;不同化學(xué)激活劑對牛卵丘細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育的影響[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年01期

5 田長永;楊景晁;馬澤芳;宋連喜;;卵丘細(xì)胞對遼寧絨山羊卵母細(xì)胞體外成熟與孤雌發(fā)育的影響[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年05期

6 夏國良;小鼠年齡及卵丘-卵母細(xì)胞間聯(lián)接的解離對卵母細(xì)胞體外成熟的影響[J];動物學(xué)報(bào);1996年04期

7 朱桂玉;馮書堂;李吉濤;牟玉蓮;潘登科;郭丙冉;;豬卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體和裸卵的卵母細(xì)胞發(fā)育及基因表達(dá)差異的研究[J];廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué);2006年S1期

8 喬利敏;喬富強(qiáng);姚華;李向臣;關(guān)偉軍;馬月輝;;不同化學(xué)激活方法及卵丘細(xì)胞層數(shù)對牛體外成熟卵母細(xì)胞孤雌發(fā)育的影響[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2011年04期

9 任晶晶;趙學(xué)明;秦彤;杜衛(wèi)華;郝海生;劉巖;王棟;朱化彬;;小鼠卵丘細(xì)胞對牛卵母細(xì)胞體外成熟和孤雌發(fā)育的影響[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2012年04期

10 梅志強(qiáng);陳青;安曉榮;姚慧;茍克勉;;自體或異體小鼠卵丘細(xì)胞核移植胚胎的發(fā)育[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2009年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 王滇;張春燕;劉松柏;楊利國;;不同化學(xué)激活劑對牛卵丘細(xì)胞重構(gòu)胚發(fā)育的影響[A];中國奶業(yè)協(xié)會年會論文集2008（上冊）[C];2008年

2 曹陳沖;徐元誠;徐建平;許娟娟;陳莉;宣玉琴;張亞云;;兔卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞體外成熟與孤雌發(fā)育的影響[A];江蘇省性學(xué)會第六次學(xué)術(shù)會議論文集[C];2006年

3 梁成光;霍立軍;鐘志勝;陳大元;孫青原;;卵丘細(xì)胞cAMP-MAPK信號通路對豬卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體減數(shù)分裂恢復(fù)的作用[A];第十屆全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

4 羅海玲;木村康二;青木真理;平子誠;趙有璋;;血管內(nèi)皮生長因子對去卵丘細(xì)胞牛胚胎體外發(fā)育的影響[A];中國青年農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)術(shù)年報(bào)[C];2002年

5 傅茂勇;陳秀芬;金世英;雷蕾;王超;宋曉明;周波;張美佳;夏國良;;促黃體激素受體(LHR)在小鼠卵丘細(xì)胞中的表達(dá)及其在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的作用[A];第十屆全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2005年

6 傅茂勇;夏國良;雷蕾;王鳳超;;LH受體在體外培養(yǎng)的小鼠卵泡及卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體模型中的定位及表達(dá)[A];動物生理生化學(xué)分會第八次學(xué)術(shù)會議暨全國反芻動物營養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編[C];2004年

7 范衡宇;霍立軍;陳大元;孫青原;;蛋白激酶C和MAPK/p90rsk對小鼠卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體減數(shù)分裂成熟的調(diào)節(jié)[A];第九次全國生殖生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2003年

8 杜明;袁佃帥;梁瑩;王亮;曾艷;朱士恩;;小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中乙�；潭壬邔β亚饠U(kuò)展的影響[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十五屆學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2010年

9 王坤;王憲龍;趙栓;曾申明;;GDF9對豬卵丘細(xì)胞Bim蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物繁殖學(xué)分會第十六屆學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2012年

10 歐陽宏;寧剛;栗俊霞;張美佳;夏國良;;PKC epsilon亞型參與FSH誘導(dǎo)小鼠卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟過程中Cx43磷酸化的調(diào)節(jié)[A];全國動物生理生化第十次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 葛麗;卵丘細(xì)胞對小鼠卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的作用及機(jī)理的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

2 耿薔;利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法尋找人卵丘細(xì)胞中的卵母細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

3 翟博;BMP15調(diào)節(jié)豬卵丘細(xì)胞凋亡的信號通路研究[D];吉林大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 魯金花;脫卵丘操作對家兔卵母細(xì)胞損傷的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

2 蘇文龍;Zebularine對綿羊卵丘細(xì)胞及其核移植胚胎發(fā)育效果的影響研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 茫烈;去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2007年

4 彭麗英;體內(nèi)外成熟卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體中卵丘細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)差異的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

5 楊華;小鼠卵丘細(xì)胞線粒體移植對早期胚胎發(fā)育潛能的影響[D];廣西大學(xué);2006年

6 歐陽效晴;生長分化因子-9對牛卵丘細(xì)胞影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 王勇勝;卵丘細(xì)胞對牛卵母細(xì)胞體外成熟及早期胚胎發(fā)育的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2004年

8 喬天武;小鼠卵丘細(xì)胞通過分泌可溶性因子促進(jìn)卵母細(xì)胞老化[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

9 陳華;豬去卵丘卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 吳吉文;透明質(zhì)酸及其相關(guān)蛋白對小鼠卵丘細(xì)胞外基質(zhì)的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

，

本文編號：2228295