【摘要】：前期研究表明TGF-β1、PDGF-B基因在LPS介導(dǎo)的小鼠乳腺上皮細胞(MECs)差異顯著的上調(diào),且小鼠MECs在LPS刺激下通過TLR4信號通路引起細胞分泌前炎癥細胞因子而調(diào)節(jié)免疫和炎癥,為了研究TGF-β1、PDGF-B基因在TLR4信號通路的作用,本研究采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)對TGF-β1和PDGF-B基因進行沉默,用實時熒光定量RT-PCR方法篩選最佳轉(zhuǎn)染條件,繼續(xù)采用實時熒光定量RT-PCR方法分別檢測它們沉默后LPS介導(dǎo)其下游信號Smad3和PI3K mRNA表達量,用ELISA方法檢測其下游信號Smad3和PI3K蛋白含量,ELISA方法檢測LPS介導(dǎo)細胞分泌前炎癥細胞因子IL-6和TNF-α的量。實驗結(jié)果顯示:選用TGF-β1-mus-1212、PDGF-B-mus-886 siRNA轉(zhuǎn)染片段50 nM、30 nM、20 nM濃度組都能極顯著抑制TGF-β1和PDGF-B的mRNA表達(P0.01),其中,TGF-β1-mus-1212片段、PDGF-B-mus-886片段的50 nM濃度下各轉(zhuǎn)染抑制率分別最高。TGF-β1沉默后,LPS刺激下其下游信號Smad3mRNA表達量和細胞分泌量與LPS對照組相比呈顯著性降低(P0.05),細胞分泌TNF-α的量比LPS對照組顯著降低(P0.05),分泌IL-6的量各組無變化(P0.05)。PDGF-B沉默后,LPS刺激下其下游PI3K的mRNA表達量與LPS對照組相比呈顯著性降低(P0.05),PI3K蛋白含量與LPS對照組相比有所降低,但差異不顯著(P0.05),細胞分泌IL-6的量與LPS對照組相比呈顯著性降低(P0.05),分泌TNF-α的量各組無變化(P0.05)。結(jié)果提示:采用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)成功對TGF-β1、PDGF-B基因沉默;小鼠MECs中TGF-β1與Smad3有直接關(guān)系,TGF-β1能引起LPS介導(dǎo)的其下游信號Smad3表達和前炎癥因子的分泌,它可能是小鼠MECs上TLR4信號通路中的關(guān)鍵基因;PDGF-B與PI3K有一定關(guān)系,PDGF-B可引起LPS介導(dǎo)的其下游信號PI3K表達和前炎癥因子的分泌,但PI3K激活可能還有其他途徑,PDGF-B可能是小鼠MECs上TLR4信號通路中的關(guān)鍵基因。因此,TGF-β1和PDGF-B基因可以作為靶基因進行更加深入的研究,能為乳腺炎癥、腫瘤等乳腺相關(guān)疾病的治療提供新的思路及實驗數(shù)據(jù),為新藥的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。
[Abstract]:Previous studies showed that TGF- 尾 1 PDGF-B gene was significantly up-regulated in (MECs) of mouse mammary epithelial cells mediated by LPS, and that mouse MECs stimulated by LPS induced the secretion of preinflammatory cytokines through TLR4 signaling pathway to regulate immunity and inflammation. In order to study the role of TGF- 尾 1 and PDGF-B gene in TLR4 signaling pathway, siRNA transfection technique was used to silence TGF- 尾 1 and PDGF-B genes, and real-time fluorescence quantitative RT-PCR was used to screen the optimal transfection conditions. Real-time fluorescence quantitative RT-PCR was used to detect the expression of Smad3 and PI3K mRNA in their downstream signal mediated by LPS after their silencing, respectively. The content of Smad3 and PI3K protein in downstream signal was detected by ELISA method and the quantity of IL-6 and TNF- 偽 secreted by LPS mediated cells was detected by Elisa. The results showed that TGF- 尾 1-mus-1212 PDGF-B-mus-886 siRNA transfection fragment 50 nM,30 nM,20 nM could significantly inhibit the mRNA expression of TGF- 尾 1 and PDGF-B (P0.01). The inhibitory rates of 50 nM on the transfection of TGF- 尾 1-mus-1212 PDGF-B-mus-886 fragment were the highest under the stimulation of TGF- 尾 1 and PDGF-B after the silencing of TGF- 尾 1. TGF- 尾 1-mus-1212 fragment and PDGF-B-mus-886 fragment of PDGF-B-mus-886, respectively. The expression of downstream signal Smad3mRNA and cell secretion were significantly lower than those of LPS control group (P0.05), the amount of TNF- 偽 secreted by cells was significantly lower than that of LPS control group (P0.05), and the amount of IL-6 secreted in each group had no change (P0.05). The mRNA table of downstream PI3K stimulated by PDGF-B silencing was significantly lower than that of LPS control group (P0.05). The content of PI3K in LPS group was significantly lower than that in control group (P0.05), and the protein content of PI3K was lower than that of LPS control group. But the difference was not significant (P0.05), the amount of IL-6 secreted by cells was significantly lower than that of LPS control group (P0.05), the amount of secreting TNF- 偽 did not change in each group (P0.05). The results suggested that TGF- 尾 1 PDGF-B gene was silenced successfully by siRNA transfection technique, and that TGF- 尾 1 in mouse MECs was directly related to Smad3, and TGF- 尾 1 could induce LPS mediated Smad3 expression and proinflammatory factor secretion. It may be that PDGF-B is a key gene in the TLR4 signaling pathway of mouse MECs. PDGF-B may induce the expression of PI3K and the secretion of proinflammatory factors mediated by LPS. However, there may be other pathways to PI3K activation. PDGF-B may be a key gene in the TLR4 signaling pathway of mouse MECs. Therefore, TGF- 尾 1 and PDGF-B genes can be used as target genes for further research, which can provide new ideas and experimental data for the treatment of breast inflammation, tumor and other mammary gland related diseases, and provide theoretical basis for the development and application of new drugs.
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.3

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本文編號：2223545