【摘要】：本文主要研究α-細辛醚對斑馬魚血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)結(jié)構(gòu)及緊密連接蛋白家族Claudin、occludin、ZO、JAM基因表達的影響,以闡明α-細辛醚開啟血腦屏障的作用機制,并對α-細辛醚的生物安全性進行評價,主要對斑馬魚的生殖毒性和胚胎發(fā)育毒性進行研究,為人畜臨床應用α-細辛醚奠定理論基礎。采用的方法主要利用心臟注射方式將大分子熒光物質(zhì)Dextran Texas Red注入斑馬魚幼魚心臟,之后將其浸泡在α-細辛醚溶液中,利用共聚焦顯微鏡觀察α-細辛醚是否能幫助大分子熒光物質(zhì)通過血腦屏障進入腦內(nèi);成年斑馬魚通過腹腔注射方式給予α-細辛醚后,利用透射電鏡觀察α-細辛醚作用斑馬魚成魚后,斑馬魚血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化;利用腦組織切片HE染色,顯微鏡觀察斑馬魚腦組織結(jié)構(gòu)的影響;利用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative,RT-qPCR)來研究α-細辛醚對斑馬魚緊密連接蛋白家族Claudin、ZO、occludin、JAM基因表達及時效性的影響;α-細辛醚的生物安全性胚胎發(fā)育毒性,取受精后3h(Hours post-ferilization,hpf)的斑馬魚胚胎放入不同濃度梯度的α-細辛醚溶液中暴露,分別觀察暴露在α-細辛醚在24hpf,48hpf,72hpf,96hpf不同時間點胚胎發(fā)育的形態(tài)現(xiàn)象,統(tǒng)計斑馬魚胚胎自主抽動的頻率、孵化率、心率、畸形率及死亡率等指標的變化,包括心包的水腫、脊柱的彎曲、尾巴的彎曲、卵黃囊水腫等現(xiàn)象;利用RT-qPCR方法來檢測斑馬魚浸泡α-細辛醚96hpf后對sepn1基因表達的影響。利用斑馬魚行為學系統(tǒng)Noldus來評價α-細辛醚對斑馬魚幼魚運動方式及運動能力的影響。由試驗得到的結(jié)果如下:斑馬魚心臟注射大分子熒光染料后,浸泡在養(yǎng)殖水和α-細辛醚中,發(fā)現(xiàn)浸泡α-細辛醚30min后斑馬魚的血管有些模糊,周圍已經(jīng)有少量的熒光物質(zhì)滲出,浸泡α-細辛醚60min后可觀察到斑馬魚血管更加的模糊,說明已經(jīng)有大量的熒光物質(zhì)從血管內(nèi)滲出,而對照組卻沒有看到熒光物質(zhì)滲出。通過電鏡觀察的結(jié)果顯示,給予α-細辛醚后,內(nèi)皮細胞出現(xiàn)輕度的皺縮,BBB的基膜出現(xiàn)膨大斷裂,緊密連接出現(xiàn)疏松。而對照組的內(nèi)皮細胞未出現(xiàn)皺縮,比較飽滿,緊密連接致密,基膜結(jié)構(gòu)完整連續(xù)。利用HE組織切片來觀察斑馬魚腦組織結(jié)構(gòu)的結(jié)果與BBB超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果相一致。腹腔注射α-細辛醚作用1h后,大部分的Claudin家族基因如Claudin-19、-k、-j、-5a、-7a、-7b、-a、-h、-11a下調(diào)。其中Claudin-5b、-11b上調(diào)。Claudin-2上下調(diào)沒有太明顯的變化。其他家族的基因如JAM,-2A、-2B、-3A、-3B、occludin-A、occludin-B均下調(diào),下調(diào)的幅度卻是不盡相同。腹腔注射α-細辛醚后,Claudin5a在1h下調(diào)最明顯,作用2h又逐漸的恢復,到8h基本恢復正常水平。將斑馬魚胚胎暴露在不同濃度的α-細辛醚溶液中,24hpf斑馬魚自主抽動的次數(shù)降低;48hpf斑馬魚的心率減低;72hpf斑馬魚幼魚有脊柱彎曲、心包水腫、尾巴彎曲、卵黃囊水腫等畸形的表征;96hpf斑馬魚幼魚的孵化率、死亡率有很大的差異;通過斑馬魚幼魚運動行為學表明隨著α-細辛醚濃度增加,斑馬魚幼魚運動受到抑制。本文的結(jié)論為芳香開竅藥能使緊密連接蛋白claudin家族基因表達下調(diào),致使緊密連接結(jié)構(gòu)疏松,加之基膜結(jié)構(gòu)破壞,內(nèi)皮細胞皺縮,使得血腦屏障的屏障作用減弱,從而開啟了血腦屏障,發(fā)揮了開竅的作用�；蚩赡嫘缘南抡{(diào)說明α-細辛醚對血腦屏障是生理性的,對腦部不會帶來病理學損傷。從用藥安全性來看,高濃度的α-細辛醚對斑馬魚胚胎發(fā)育有明顯毒性作用。提示人畜臨床慎用α-細辛醚。
[Abstract]:The effect of alpha-asarone on the structure of blood brain barrier (BBB) and the expression of tight junction protein family Claudin, occludin, ZO, JAM genes in zebrafish was studied in order to elucidate the mechanism of alpha-asarone opening blood brain barrier, and to evaluate the biological safety of alpha-asarone, mainly on the reproductive toxicity and the expression of JAM genes in zebrafish. The embryo development toxicity was studied to lay a theoretical foundation for the clinical application of alpha-asarone in human and livestock.Dextran Texas Red was injected into the heart of juvenile zebrafish by cardiac injection and then immersed in alpha-asarone solution. Macromolecular fluorescent substances entered the brain through the blood-brain barrier (BBB), and the ultrastructure of the BBB was observed by transmission electron microscopy (TEM) after the adult zebrafish were injected with alpha-asarone via abdominal cavity. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to study the effects of alpha-asarone on the expression and timeliness of Claudin, ZO, occludin and JAM genes in zebrafish tightly junction proteins; the biological safety of alpha-asarone on embryonic development toxicity and the insemination of 3 h (Hours post-ferilization, hpf) zebrafish embryos into different concentrations. The morphological changes of embryos at 24 hpf, 48 hpf, 72 HPF and 96 HPF were observed. The frequency of spontaneous twitching, hatching rate, heart rate, deformity rate and mortality of zebrafish embryos were measured, including pericardial edema, spinal curvature, tail curvature, yolk, etc. The effect of alpha-asarone on SEPN1 gene expression in zebrafish was detected by RT-qPCR. The effect of alpha-asarone on movement pattern and ability of juvenile zebrafish was evaluated by Noldus, a zebrafish behavioral system. After soaking in culture water and alpha-asarone ether, it was found that the blood vessels of zebrafish were blurred after soaking in alpha-asarone ether for 30 minutes, and a small amount of fluorescent substances were exuded. After soaking in alpha-asarone for 60 minutes, the blood vessels of zebrafish became more blurred, indicating that a large amount of fluorescent substances had exuded from the blood vessels, but not seen in the control group. The results of electron microscopy showed that after administration of alpha-asarone, the endothelial cells contracted slightly, the basement membrane of BBB expanded and ruptured, and the tight junction loosened. After intraperitoneal injection of alpha-asarone for one hour, most of the Claudin family genes, such as Claudin-19, -k, -j, -5a, -7a, -7b, -a, -h, -11a, were down-regulated. Claudin-5b, -11b was up-regulated. Claudin-2 was not up-regulated. Other family genes such as JAM, -2A, -2B, -3A, o, 3B, etc. After intraperitoneal injection of alpha-asarone, Claudin 5A was down-regulated most obviously at 1 h, and recovered gradually at 2 h, and returned to normal level at 8 h. After exposing zebrafish embryos to different concentrations of alpha-asarone, the number of spontaneous twitches of 24hpf zebrafish decreased. The results showed that the hatching rate and mortality of juvenile zebrafish at 96 HPF were significantly different, and the movement of juvenile zebrafish was inhibited with the increase of concentration of alpha-asarone. Aromatic rehabilitative drugs can down-regulate the gene expression of claudin family, resulting in loose tight junction structure, destruction of basement membrane structure and shrinkage of endothelial cells, weakening the barrier function of blood brain barrier, thus opening the blood brain barrier and playing an enlightening role. Physiologically, it does not cause pathological damage to the brain. In terms of drug safety, high concentration of alpha-asarone has obvious toxic effect on zebrafish embryo development. It suggests that human and animal clinical use of alpha-asarone cautiously.
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S853.7

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本文編號：2195921