發(fā)布時(shí)間：2018-08-21 13:45

【摘要】：本文主要研究α-細(xì)辛醚對(duì)斑馬魚(yú)血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)結(jié)構(gòu)及緊密連接蛋白家族Claudin、occludin、ZO、JAM基因表達(dá)的影響,以闡明α-細(xì)辛醚開(kāi)啟血腦屏障的作用機(jī)制,并對(duì)α-細(xì)辛醚的生物安全性進(jìn)行評(píng)價(jià),主要對(duì)斑馬魚(yú)的生殖毒性和胚胎發(fā)育毒性進(jìn)行研究,為人畜臨床應(yīng)用α-細(xì)辛醚奠定理論基礎(chǔ)。采用的方法主要利用心臟注射方式將大分子熒光物質(zhì)Dextran Texas Red注入斑馬魚(yú)幼魚(yú)心臟,之后將其浸泡在α-細(xì)辛醚溶液中,利用共聚焦顯微鏡觀察α-細(xì)辛醚是否能幫助大分子熒光物質(zhì)通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi);成年斑馬魚(yú)通過(guò)腹腔注射方式給予α-細(xì)辛醚后,利用透射電鏡觀察α-細(xì)辛醚作用斑馬魚(yú)成魚(yú)后,斑馬魚(yú)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的變化;利用腦組織切片HE染色,顯微鏡觀察斑馬魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)的影響;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative,RT-qPCR)來(lái)研究α-細(xì)辛醚對(duì)斑馬魚(yú)緊密連接蛋白家族Claudin、ZO、occludin、JAM基因表達(dá)及時(shí)效性的影響;α-細(xì)辛醚的生物安全性胚胎發(fā)育毒性,取受精后3h(Hours post-ferilization,hpf)的斑馬魚(yú)胚胎放入不同濃度梯度的α-細(xì)辛醚溶液中暴露,分別觀察暴露在α-細(xì)辛醚在24hpf,48hpf,72hpf,96hpf不同時(shí)間點(diǎn)胚胎發(fā)育的形態(tài)現(xiàn)象,統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)胚胎自主抽動(dòng)的頻率、孵化率、心率、畸形率及死亡率等指標(biāo)的變化,包括心包的水腫、脊柱的彎曲、尾巴的彎曲、卵黃囊水腫等現(xiàn)象;利用RT-qPCR方法來(lái)檢測(cè)斑馬魚(yú)浸泡α-細(xì)辛醚96hpf后對(duì)sepn1基因表達(dá)的影響。利用斑馬魚(yú)行為學(xué)系統(tǒng)Noldus來(lái)評(píng)價(jià)α-細(xì)辛醚對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)方式及運(yùn)動(dòng)能力的影響。由試驗(yàn)得到的結(jié)果如下:斑馬魚(yú)心臟注射大分子熒光染料后,浸泡在養(yǎng)殖水和α-細(xì)辛醚中,發(fā)現(xiàn)浸泡α-細(xì)辛醚30min后斑馬魚(yú)的血管有些模糊,周圍已經(jīng)有少量的熒光物質(zhì)滲出,浸泡α-細(xì)辛醚60min后可觀察到斑馬魚(yú)血管更加的模糊,說(shuō)明已經(jīng)有大量的熒光物質(zhì)從血管內(nèi)滲出,而對(duì)照組卻沒(méi)有看到熒光物質(zhì)滲出。通過(guò)電鏡觀察的結(jié)果顯示,給予α-細(xì)辛醚后,內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)輕度的皺縮,BBB的基膜出現(xiàn)膨大斷裂,緊密連接出現(xiàn)疏松。而對(duì)照組的內(nèi)皮細(xì)胞未出現(xiàn)皺縮,比較飽滿,緊密連接致密,基膜結(jié)構(gòu)完整連續(xù)。利用HE組織切片來(lái)觀察斑馬魚(yú)腦組織結(jié)構(gòu)的結(jié)果與BBB超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果相一致。腹腔注射α-細(xì)辛醚作用1h后,大部分的Claudin家族基因如Claudin-19、-k、-j、-5a、-7a、-7b、-a、-h、-11a下調(diào)。其中Claudin-5b、-11b上調(diào)。Claudin-2上下調(diào)沒(méi)有太明顯的變化。其他家族的基因如JAM,-2A、-2B、-3A、-3B、occludin-A、occludin-B均下調(diào),下調(diào)的幅度卻是不盡相同。腹腔注射α-細(xì)辛醚后,Claudin5a在1h下調(diào)最明顯,作用2h又逐漸的恢復(fù),到8h基本恢復(fù)正常水平。將斑馬魚(yú)胚胎暴露在不同濃度的α-細(xì)辛醚溶液中,24hpf斑馬魚(yú)自主抽動(dòng)的次數(shù)降低;48hpf斑馬魚(yú)的心率減低;72hpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)有脊柱彎曲、心包水腫、尾巴彎曲、卵黃囊水腫等畸形的表征;96hpf斑馬魚(yú)幼魚(yú)的孵化率、死亡率有很大的差異;通過(guò)斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為學(xué)表明隨著α-細(xì)辛醚濃度增加,斑馬魚(yú)幼魚(yú)運(yùn)動(dòng)受到抑制。本文的結(jié)論為芳香開(kāi)竅藥能使緊密連接蛋白claudin家族基因表達(dá)下調(diào),致使緊密連接結(jié)構(gòu)疏松,加之基膜結(jié)構(gòu)破壞,內(nèi)皮細(xì)胞皺縮,使得血腦屏障的屏障作用減弱,從而開(kāi)啟了血腦屏障,發(fā)揮了開(kāi)竅的作用。基因可逆性的下調(diào)說(shuō)明α-細(xì)辛醚對(duì)血腦屏障是生理性的,對(duì)腦部不會(huì)帶來(lái)病理學(xué)損傷。從用藥安全性來(lái)看,高濃度的α-細(xì)辛醚對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育有明顯毒性作用。提示人畜臨床慎用α-細(xì)辛醚。
[Abstract]:The effect of alpha-asarone on the structure of blood brain barrier (BBB) and the expression of tight junction protein family Claudin, occludin, ZO, JAM genes in zebrafish was studied in order to elucidate the mechanism of alpha-asarone opening blood brain barrier, and to evaluate the biological safety of alpha-asarone, mainly on the reproductive toxicity and the expression of JAM genes in zebrafish. The embryo development toxicity was studied to lay a theoretical foundation for the clinical application of alpha-asarone in human and livestock.Dextran Texas Red was injected into the heart of juvenile zebrafish by cardiac injection and then immersed in alpha-asarone solution. Macromolecular fluorescent substances entered the brain through the blood-brain barrier (BBB), and the ultrastructure of the BBB was observed by transmission electron microscopy (TEM) after the adult zebrafish were injected with alpha-asarone via abdominal cavity. Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to study the effects of alpha-asarone on the expression and timeliness of Claudin, ZO, occludin and JAM genes in zebrafish tightly junction proteins; the biological safety of alpha-asarone on embryonic development toxicity and the insemination of 3 h (Hours post-ferilization, hpf) zebrafish embryos into different concentrations. The morphological changes of embryos at 24 hpf, 48 hpf, 72 HPF and 96 HPF were observed. The frequency of spontaneous twitching, hatching rate, heart rate, deformity rate and mortality of zebrafish embryos were measured, including pericardial edema, spinal curvature, tail curvature, yolk, etc. The effect of alpha-asarone on SEPN1 gene expression in zebrafish was detected by RT-qPCR. The effect of alpha-asarone on movement pattern and ability of juvenile zebrafish was evaluated by Noldus, a zebrafish behavioral system. After soaking in culture water and alpha-asarone ether, it was found that the blood vessels of zebrafish were blurred after soaking in alpha-asarone ether for 30 minutes, and a small amount of fluorescent substances were exuded. After soaking in alpha-asarone for 60 minutes, the blood vessels of zebrafish became more blurred, indicating that a large amount of fluorescent substances had exuded from the blood vessels, but not seen in the control group. The results of electron microscopy showed that after administration of alpha-asarone, the endothelial cells contracted slightly, the basement membrane of BBB expanded and ruptured, and the tight junction loosened. After intraperitoneal injection of alpha-asarone for one hour, most of the Claudin family genes, such as Claudin-19, -k, -j, -5a, -7a, -7b, -a, -h, -11a, were down-regulated. Claudin-5b, -11b was up-regulated. Claudin-2 was not up-regulated. Other family genes such as JAM, -2A, -2B, -3A, o, 3B, etc. After intraperitoneal injection of alpha-asarone, Claudin 5A was down-regulated most obviously at 1 h, and recovered gradually at 2 h, and returned to normal level at 8 h. After exposing zebrafish embryos to different concentrations of alpha-asarone, the number of spontaneous twitches of 24hpf zebrafish decreased. The results showed that the hatching rate and mortality of juvenile zebrafish at 96 HPF were significantly different, and the movement of juvenile zebrafish was inhibited with the increase of concentration of alpha-asarone. Aromatic rehabilitative drugs can down-regulate the gene expression of claudin family, resulting in loose tight junction structure, destruction of basement membrane structure and shrinkage of endothelial cells, weakening the barrier function of blood brain barrier, thus opening the blood brain barrier and playing an enlightening role. Physiologically, it does not cause pathological damage to the brain. In terms of drug safety, high concentration of alpha-asarone has obvious toxic effect on zebrafish embryo development. It suggests that human and animal clinical use of alpha-asarone cautiously.
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S853.7

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本文編號(hào)：2195921