【摘要】：本研究以小鼠為模型,通過探討卵母細胞線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)拷貝數(shù)的變化以及卵巢抗氧化能力的強弱等,研究表兒茶素(Epicatechin, EC)對體外成熟(Matured in vitro, IVM)卵母細胞以及經(jīng)重復(fù)超數(shù)排卵體內(nèi)成熟卵母細胞成熟質(zhì)量的影響,并進一步闡明線粒體DNA與卵母細胞發(fā)育潛能之間的關(guān)系,以及EC影響卵母細胞成熟的作用機制。首先,探討了表兒茶素對體外成熟小鼠卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)和發(fā)育潛能的影響。小鼠卵丘-卵母細胞復(fù)合體(Cumulus-Oocyte Complexs, COCs)分別在添加不同濃度EC (0 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L,15 μmol/L和20 μmol/L)的成熟培養(yǎng)液中體外成熟培養(yǎng)16 h后,添加EC各處理組的卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)均有所增加,其中,10 μmol/L組和15 μmol/L組的mtDNA拷貝數(shù)均顯著高于空白對照組(分別為618223±220584,777851±120487,對照組為304380±60963,P0.05)；但10 μmol/L組mtDNA拷貝數(shù)更接近自然排卵周期卵子的mtDNA含量(618223±220584 vs 587688±204035,P0.05)。體外成熟培養(yǎng)及孤雌激活的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成熟液中添加10 μmol/L EC組的卵母細胞第一極體排出率與對照組相比差異不顯著(P0.05),但能顯著提高卵母細胞孤雌激活后胚胎的囊胚發(fā)育率(55.71%±2.84%vs 48.04%±3.54%,P0.05)。其次,探索表兒茶素處理小鼠的用藥方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射EC組(495758±±±76910)和灌胃EC組(523196±±±89292)小鼠卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)差異不顯著(P0.05)；而與各自的空載對照組相比mtDNA拷貝數(shù)均顯著增加(495758±±±76910 vs281266±42266,523196±89292 vs 275836±±±33959,P0.05)；注射EC組卵巢組織PGC-1α和Tfam基因的表達量與空載對照組相比均上調(diào),且差異顯著(P0.05)；注射EC 2d組(489723士148982)和注射EC 7 d組(495758±203486)的mtDNA拷貝數(shù)差異不顯著(P0.05),且均顯著高于對照組(285786±99988,P0.05)；超排期間注射EC組與對照組相比,獲卵數(shù)沒有顯著差異(22.80±5.84 vs 21.35士5.12,P0.05)。最后,探討了超排期間注射表兒茶素對重復(fù)超排小鼠卵母細胞發(fā)育潛能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著超排次數(shù)的增加,對照組獲得的2-cell胚胎數(shù)顯著減少,而EC處理組沒有顯著變化,并均與超排1次對照組獲取的胚胎數(shù)差異不顯著(20.25±1.06 vs 19.25±1.95 vs 20.33±1.61 vs 21.00±0.71, P0.05):胚胎進行體外培養(yǎng)后,發(fā)育到囊胚的比率和孵化囊胚率隨著超排次數(shù)的增加呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢,對照組的孵化囊胚率顯著下降(超排1次為62.65±0.21；超排3次為53.52±3.13；超排5次為42.81±4.83,P0.05),但EC處理組孵化囊胚率和總囊胚率下降幅度相對較��；當超排次數(shù)增加至5次后,EC組和對照組的囊胚細胞凋亡率均顯著增加(P0.05),對照組的細胞凋亡率顯著大于EC組(3.74±0.86 vs 3.10±0.74,P0.05)。熒光定量分析結(jié)果顯示：超排1次時,EC處理組2-cell胚胎mtDNA拷貝數(shù)顯著高于對照組(489723±148982 vs 298333±139487,P0.05),然而連續(xù)超排3次和5次后,EC組與對照組的mtDNA拷貝數(shù)均大幅度增加,且各組間的差異不顯著(769066±389862 vs 811676±473759 vs 743958± 224432 vs 771691±341214,P0.05)；與超排5次對照組相比,超排5次EC組小鼠卵巢組織GPX1、PRDX3、SOD和GLS2四種抗氧化酶基因表達均顯著上調(diào),卵巢GSH含量顯著提高(46.68士2.67 vs 37.74士3.80,P0.05)。以上結(jié)果表明：(1)體外成熟液中添加適宜濃度(10μmol/L)的EC可提高小鼠卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)及其發(fā)育潛能；(2)通過灌胃和注射方法補充純EC,均可以促進小鼠卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)增多；(3)小鼠超排期間注射一定劑量(10mg/kg體重)的EC可使卵母細胞的mtDNA拷貝數(shù)增多,但不影響獲卵數(shù)；(4)隨著連續(xù)超排次數(shù)的增加,獲得的胚胎數(shù)目減少、質(zhì)量下降；然而,超排期間注射EC,能夠明顯改善上述異常。
[Abstract]:In this study, the effects of epicatechin (EC) on in vitro maturation (Matured in vitro, IVM) oocytes and maturation quality of matured oocytes in vivo after Repeated Superovulation were studied by investigating the changes of mitochondrial DNA (mtDNA) copy number and ovarian antioxidant capacity in mice. The relationship between mitochondrial DNA and oocyte development potential and the mechanism of EC affecting oocyte maturation were further elucidated. Firstly, the effects of epicatechin on mtDNA copy number and developmental potential of mouse oocytes matured in vitro were investigated. After 16 hours of maturation in vitro, the mtDNA copy number of oocytes treated with EC (0 micromol/L, 5 micromol/L, 10 micromol/L, 15 micromol/L and 20 micromol/L) increased significantly. The mtDNA copy number of oocytes treated with EC was significantly higher in 10 micromol/L group and 15 micromol/L group than that of blank control group (618 223 + 220, respectively). 584,777851 (+ 120487) and 304380 (+ 60963, P 0.05) in the control group, but the mtDNA copy number in the 10 micromol / L group was closer to that in the natural ovulation cycle (618223 (+ 220584) vs 587688 (+ 204035, P 0.05). The results of in vitro maturation culture and parthenogenetic activation showed that the first polar body excretion rate of oocytes in the 10 micromol / L EC group was higher than that in the control group. There was no significant difference between the two groups (P 0.05), but the blastocyst development rate of parthenogenetically activated oocytes was significantly increased (55.71% + 2.84% vs 48.04% + 3.54%, P 0.05). Secondly, the method of treating mice with epicatechin was explored. There was no significant difference in the number of mtDNA copies (P 0.05), but the number of mtDNA copies increased significantly (P 0.05) compared with the control group (P 0.05); the expression of PGC-1a and Tfam genes in ovarian tissue of EC group were up-regulated compared with the control group (P 0.05). There was no significant difference in the number of mtDNA copies (P 0.05) between EC 2D injection group (489723s 148982) and EC 7d injection group (495758 (+203486)) and control group (285786 (+99988, P 0.05); there was no significant difference in the number of eggs (22.80 (+5.84 vs 21.35 vs 5.12, P 0.05) between EC 2D injection group and EC 7d injection group (495758 (+203486)). The results showed that the number of 2-cell embryos obtained in the control group decreased significantly with the increase of the number of superovulation, while the number of 2-cell embryos obtained in the EC treatment group did not change significantly, and there was no significant difference between the two groups (20.25 (+ 1.06 vs 19.25 (+ 1.95 vs 20.33 (+ 1.61 vs 21.00)) and that obtained in the control group at the first superovulation. After in vitro culture, the rate of blastocyst development to blastocyst and the rate of hatching blastocyst decreased gradually with the increase of the number of superovulation. The rate of hatching blastocyst in the control group decreased significantly (62.65 + 0.21 for one time, 53.52 + 3.13 for three times, 42.81 + 4.83 for five times, P 0.05 for five times), but the rate of hatching blastocyst in the EC treatment group decreased significantly (62.65 + 0.21 for one time, 53.52 + 3.13 for three times, 42.81 + 4.83 for five times When the number of superovulation increased to 5 times, the apoptosis rate of blastocysts in EC group and control group increased significantly (P 0.05). The apoptosis rate of blastocysts in control group was significantly higher than that in EC group (3.74 + 0.86 vs 3.10 + 0.74, P 0.05). It was significantly higher than that of the control group (489723 + 148982 vs 298333 + 139487, P 0.05). However, after three and five successive superovulation, the number of mtDNA copies in the EC group and the control group increased significantly, and there was no significant difference among the groups (769066, 389862 vs 811676, 473759 vs 743958, 224432 vs 771691, 341214, P 0.05). The expression of four antioxidant enzymes GPX1, PRDX3, SOD and GLS2 in ovarian tissues of mice in group A was significantly up-regulated, and the content of GSH in ovary was significantly increased (46.68 s 2.67 vs 37.74 s 3.80, P 0.05). Both intragastric administration and injection of pure EC could increase the mtDNA copy number of mouse oocytes; (3) EC at a certain dose (10 mg/kg body weight) could increase the mtDNA copy number of mouse oocytes during superovulation, but did not affect the number of oocytes harvested; (4) with the increase of the number of successive superovulation, the number of embryos obtained decreased and the quality decreased; However, injection of EC during the superovulation can significantly improve the above abnormalities.
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S814

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本文編號：2190772