【摘要】：亞急性瘤胃酸中毒（SARA）是由于反芻動物攝取大量快速發(fā)酵的碳水化合物，使瘤胃VFA蓄積，pH降低，瘤胃菌群紊亂所引發(fā)的一種以發(fā)病隱襲為臨床特征的群發(fā)性消化障礙性疾病。瘤胃上皮是機體防御病原微生物感染的第一道防線也是營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)化的重要器官。雖然臨床研究表明，SARA與瘤胃炎、肝膿腫、蹄葉炎和后腔靜脈栓塞綜合征等炎性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。但瘤胃內(nèi)容物對瘤胃壁的局部炎性作用和全身的炎性作用還不清楚，其炎性信號通的研究還未見報道。 本實驗采用體內(nèi)體外實驗相結(jié)合的研究策略。體內(nèi)實驗：檢測瘤胃液VFA和血液相關(guān)炎性指標(biāo)IL-1β、IL-6、TNF-α含量，結(jié)合瘤胃組織學(xué)形態(tài)學(xué)，結(jié)果顯示SARA與瘤胃組織的炎性損傷相關(guān)。體外實驗：建立體外犢牛瘤胃上皮細胞培養(yǎng)方法。用不同低pH培養(yǎng)基處理細胞，分別添加不同濃度的VFA處理細胞。運用Western Blot和RT-PCR技術(shù)研究其對NF-κB、p38炎性通路及其下游炎性因子的影響。 建立瘤胃上皮細胞培養(yǎng)方法，使用連續(xù)胰酶消化法分離細胞。然后對細胞進行生化和形態(tài)學(xué)的鑒定。細胞陽性表達細胞角蛋白CK-18，形態(tài)學(xué)上呈典型的鋪路石狀，超微結(jié)構(gòu)形態(tài)具有典型的微絨毛、橋粒、緊密連接等上皮特征，在第4天細胞增殖活性和乳酸脫氫酶活性最強�？梢宰鳛榧毎Ｐ脱芯苛鑫傅纳�、病理分子生物學(xué)。 體外培養(yǎng)犢牛瘤胃上皮細胞,研究低pH環(huán)境對瘤胃上皮細胞炎性因子表達的影響。在不同pH（5.5和7.2）的培養(yǎng)環(huán)境下處理細胞，檢測NF-κB p65和IκB蛋白的表達與細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB p65mRNA表達。結(jié)果顯示，在低pH環(huán)境（pH5.5）處理組，NF-κB p65和IκB蛋白的表達顯著升高；IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κBp65的mRNA表達水平均顯著或極顯著高于對照組(P0.05/P0.01)。 為了進一步驗證不同濃度VFA對瘤胃上皮細胞炎性信號通路的作用。設(shè)置處理組：0，×1倍濃度，，×5倍濃度VFA，PDTC抑制劑20mM，PDTC抑制劑20mM+×5倍濃度VFA，SB203580，SB203580+×5倍濃度。結(jié)果顯示，高濃度VFA活化NF-κB、p38炎性通路及其下游炎性因子。 牛SARA對瘤胃上皮細胞炎性信號通路的活化，不僅受低pH的影響，還受VFA濃度的影響，說明SARA的致炎作用是低pH和高濃度VFA兩因素共同作用的結(jié)果。
[Abstract]:Subacute rumen acidosis (SARA) is a group of digestive disorders caused by rapid uptake of carbohydrates by ruminants, which reduces rumen VFA accumulation and pH, and caused by rumen microbial disturbance. Rumen epithelium is not only the first line of defense against pathogenic microorganism infection, but also an important organ for nutrient absorption and transformation. Although clinical studies have shown that sara is closely associated with inflammatory diseases such as rumen gastritis, liver abscess, hoofleaf disease and posterior vena cava embolism syndrome. However, the local and systemic inflammatory effects of rumen contents on rumen wall are not clear, and the study of inflammatory signaling has not been reported. In this experiment, the research strategy of in vivo and in vitro experiment was adopted. In vivo experiment: the contents of VFA in rumen fluid and IL-1 尾 -IL-6 TNF- 偽 in blood were detected. The results showed that SARA was related to the inflammatory injury of rumen tissue. In vitro experiment: to establish the culture method of rumen epithelial cells of calf in vitro. The cells were treated with different low pH medium and different concentrations of VFA. The effects of Western Blot and RT-PCR on NF- 魏 B p38 inflammatory pathway and its downstream inflammatory factors were studied. The culture method of rumen epithelial cells was established and the cells were isolated by trypsin digestion. Then the cells were identified by biochemical and morphological methods. The cytokeratin (CK-18) expressed in the cells was characterized by typical paving stone morphology and typical microvilli desmosomes and tight junctions. On the 4th day the cell proliferation activity and lactate dehydrogenase activity were the highest. It can be used as a cell model to study the physiological and pathological molecular biology of rumen. To study the effect of low pH on the expression of inflammatory factors in rumen epithelial cells of calf in vitro. The expression of NF- 魏 B p65 and I 魏 B protein and the expression of cytokine IL-1 尾 -IL-6, TNF- 偽 and NF- 魏 B p65mRNA were detected under different pH (5.5 and 7.2) culture conditions. The results showed that the expression of NF- 魏 B p65 and I 魏 B protein in low pH environment (pH5.5) was significantly higher than that in control group (P0.05/P0.01). To further verify the effects of different concentrations of VFA on the inflammatory signaling pathway of rumen epithelial cells. In the treatment group, the concentration of VFAPDTC inhibitor 20mM 脳 5 times, the concentration of 1: 1, and the concentration of VFA-PDTC inhibitor 20mMmMtc were 20 mMTC 脳 5, VFASB203580, SB203580 脳 5 脳 5 times, respectively. The results showed that high concentration of VFA activated NF- 魏 B p38 inflammatory pathway and its downstream inflammatory factors. The activation of inflammatory signaling pathway in rumen epithelial cells by bovine SARA was affected not only by low pH but also by the concentration of VFA, indicating that the inflammatory effect of SARA was the result of both low pH and high concentration of VFA.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.23

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本文編號：2175890