發(fā)布時間：2018-08-08 17:35

【摘要】：禽呼腸孤病毒(Avian reovirus,ARV)是家禽的重要病原之一,其感染可引起雞和火雞的病毒性關節(jié)炎、腱鞘炎等,并引起免疫抑制,給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經濟損失。本實驗室前期已證實ARV感染能夠在體外誘導細胞自噬的產生,且自噬有利于病毒的復制,并與ARV的致病機制有關。但是,ARV感染在體內是否也能夠誘導細胞自噬及影響病毒的復制,還需要進一步驗證。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3/Atg8)是自噬體膜上的標記性蛋白,其表達水平在某種程度上反映了自噬的程度。本研究首先用ARVGX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞,并設立空白及陽性對照組,采集組織器官進行LC3蛋白檢測,評價ARV感染能否誘導體內細胞自噬。結果顯示,ARV感染SPF雞48h后,即在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸、法氏囊、胸腺等組織器官內出現(xiàn)了LC3-I向LC3-Ⅱ的轉化,且心臟、盲腸、法氏囊的變化最為明顯。進一步用透射電子顯微鏡觀察ARV感染雞的心臟、盲腸和法氏囊,可發(fā)現(xiàn)變性的線粒體和典型自噬體等超微結構的存在。上述結果說明ARV感染能夠在SPF雞體內誘導細胞自噬的發(fā)生。用ARVGX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞,分別于感染48h、72h、96h和120h后采取心臟、盲腸和法氏囊進行LC3蛋白檢測,結果顯示,感染雞的心臟、盲腸和法氏囊中LC3-Ⅱ蛋白的表達水平隨著時間的增加而增加,在72h或96h時達到高峰,96h后則遞減。隨后,將采取的心臟、盲腸以及法氏囊等組織處理后感染CEF細胞,用TCID50方法進行病毒滴度的檢測,結果顯示,心臟、盲腸和法氏囊均在72h時病毒復制水平達到高峰,96h后病毒復制水平則逐漸降低,說明ARV感染SPF雞后誘導的自噬與病毒復制水平之間具有一定的時間依賴性,LC3-Ⅱ的表達水平和病毒復制水平均在病毒感染后72h或96h內顯著升高。進一步證明,ARV感染不僅能夠在雞體內誘導自噬的發(fā)生,且能利用ARV感染觸發(fā)的短暫自噬在體內進行病毒的復制與擴散,使得病毒復制水平在短時間內得到提高。本研究使用自噬抑制劑氯喹(CQ)對1日齡SPF雞預處理后,接種ARV GX/2010/1毒株,采集心臟、盲腸和法氏囊進行LC3蛋白檢測及病毒滴度的測定。結果顯示,ARV感染雞心臟內LC3-Ⅱ蛋白累積明顯,而盲腸和法氏囊內LC3-Ⅱ蛋白也有所累積,表明CQ能夠抑制ARV感染誘導的細胞自噬。進一步將心臟、盲腸和法氏囊處理后感染CEF細胞,用TCID50方法檢測病毒滴度,結果顯示,使用CQ能抑制心臟和盲腸內ARV的復制,但在法氏囊中這種現(xiàn)象并不明顯,說明CQ能夠在抑制細胞自噬的基礎上抑制心臟和盲腸內的病毒復制。總之,本研究證明ARV GX/2010/1毒株感染1日齡SPF雞后能夠在體內誘導自噬的發(fā)生,但這種自噬現(xiàn)象是短期的,且自噬水平與病毒的復制具有一定的時間依賴性；ARV能夠利用機體的短期自噬使得病毒滴度得到短暫的升高；使用自噬抑制劑CQ能夠導致組織器官細胞內LC3-Ⅱ蛋白的累積,并能使得病毒復制水平略有降低。
[Abstract]:Avian reovirus (ARV) is one of the important pathogens of poultry. The infection can cause viral arthritis of chicken and Turkey, tenosynovitis and so on, and cause immunosuppression and cause great economic loss to poultry industry. This laboratory has proved that ARV infection can induce autophagy in vitro, and autophagy is beneficial to the virus. Replication is related to the pathogenesis of ARV. However, it is also necessary to further verify whether ARV infection can also induce autophagy in the body and to affect the replication of the virus. Microtubule related protein 1 light chain 3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3/Atg8) is a marker protein on the autophagic membrane, and its expression level is in a certain range. In this study, the degree of autophagy was reflected in this study. First, 1 days old SPF chickens were infected with ARVGX/2010/1 strains and a blank and positive control group was set up. The LC3 protein of the tissues and organs was collected to evaluate whether ARV infection could induce autophagy in the body of the body. The results showed that after ARV infection of SPF chicken 48h, it was in the heart, liver, spleen, kidney, cecum, bursa, thymus. The transformation of LC3-I to LC3- II in the tissues and organs, and the most obvious changes in the heart, the cecum and the bursa of the Fabricius were observed. Further transmission electron microscopy was used to observe the heart, the cecum and the bursa of the fowl by the transmission electron microscope. The ultrastructure of the denatured mitochondria and the typical autophagic bodies could be found. The results indicated that the ARV infection could be found in the SPF chicken body. Induction of autophagy in cell autophagy. 1 days old SPF chickens were infected with ARVGX/2010/1 strains. After infection of 48h, 72h, 96h and 120h, the LC3 protein was detected in the heart, the cecum and the bursa of Fabricius. The results showed that the expression level of LC3- II protein in the heart, cecum and bursa of the infected chickens increased with the time, and reached the peak at 72h or 96h, 9. After 6h, the CEF cells were infected by the heart, the cecum and the bursa of Fabricius, and the virus titer was detected by TCID50. The results showed that the viral replication level of the heart, the cecum and the bursa of the Fabricius reached the peak at 72h, and the replication of the virus was gradually reduced after 96h, indicating the autophagy induced by ARV infected SPF chickens. There is a time dependence between the level of virus replication and the expression level of LC3- II and the level of virus replication in 72h or 96h after the virus infection. It is further proved that ARV infection can not only induce autophagy in chicken, but also use the transient autophagy triggered by ARV infection to reproduce and spread the virus in the body. The replication level of the virus was improved in a short time. In this study, the autophagic inhibitor chloroquine (CQ) was used to inoculate the ARV GX/2010/1 strain of the 1 day old SPF chicken and collect the LC3 protein and the virus titer in the heart, the cecum and the bursa of the Fabricius. The results showed that the accumulation of LC3- II protein in the heart of ARV infected chickens was obvious, and the cecum and the cecum were in the cecum and in the cecum. The LC3- II protein in the bursa was also accumulated, indicating that CQ could inhibit autophagy induced by ARV infection. CEF cells were infected after the treatment of heart, cecum and bursa, and the virus titer was detected by TCID50. The results showed that the use of CQ could inhibit the reproduction of ARV in the heart and the cecum, but the phenomenon was not obvious in the bursa of Fabricius, indicating C Q can inhibit the replication of virus in the heart and the cecum on the basis of inhibition of autophagy. In a word, this study shows that the ARV GX/2010/1 strain can induce autophagy in the body of 1 day old SPF chickens, but this autophagy phenomenon is short-term, and the level of autophagy is dependent on the replication of the virus; ARV can be used to use the machine. The short-term autophagy of the body increases the virus titer briefly, and the use of autophagy inhibitor CQ can lead to the accumulation of LC3- II protein in the tissues and organs, and can reduce the replication level of the virus slightly.
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2172516