【摘要】：為建立快速、特異鑒別檢測牛結節(jié)性皮膚病病毒(LSDV)的方法,本研究參照GenBank中發(fā)表的LSDV全基因組序列,設計并合成一對特異性引物和探針,經優(yōu)化條件,建立了可鑒別LSDV的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法。結果顯示,該方法可特異性檢測LSDV,而與山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛痘病毒和豬痘病毒均無交叉反應;標準曲線在各濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系,該方法建立的標準曲線方程為y=-3.141x+32.10,線性相關系數(shù)為0.999,擴增效率達到108%,最低檢出下限為1.48 copies/L;組內、組間重復性試驗的變異系數(shù)均小于2%。采用此方法對52份模擬臨床樣品和112份臨床樣本的檢測結果顯示:32份模擬陽性樣品檢出LSDV核酸陽性,20份模擬陰性樣品未檢出LSDV;而用OIE推薦的普通PCR方法僅檢出28份模擬陽性樣品的LSDV核酸陽性,24份模擬樣品的LSDV核酸陰性(其中20份為模擬陰性樣品,4份為模擬陽性樣品);兩種方法均未從112份臨床樣品中檢出LSDV核酸陽性。上述結果表明,熒光PCR的敏感性明顯優(yōu)于普通PCR,能夠快速準確地檢測LSDV,適用于臨床樣品的檢測,為外來疫病防控提供了技術支撐。
[Abstract]:In order to establish a rapid and specific method for the identification and detection of bovine nodular dermatosis virus (LSDV), a pair of specific primers and probes were designed and synthesized according to the LSDV genome sequence published in GenBank. A fluorescence quantitative PCR method for the identification of LSDV by TaqMan-MGB was established. The results showed that the method could specifically detect LSDV, but had no cross reaction with goat pox virus, sheep pox virus, cowpox virus and porcine pox virus, and the standard curve showed a good linear relationship in different concentration range. The standard curve equation established by this method is yap-3.141x 32.10, the linear correlation coefficient is 0.999 9, the amplification efficiency reaches 108, the lowest detection limit is 1.48 copies-L, and the coefficient of variation of the repeatability test between groups is less than 2%. By using this method, 52 simulated clinical samples and 112 clinical samples were tested. The results showed that LSDV nucleic acid positive samples were detected in 32 LSDV positive samples and 20 analogue negative samples were not detected, but only 28 cases were detected by the ordinary PCR method recommended by OIE. LSDV nucleic acid was negative in 24 LSDV nucleic acid positive samples (of which 20 were simulated negative samples, 4 were simulated positive samples), and LSDV nucleic acid was not detected in 112 clinical samples by both methods. The results show that the sensitivity of fluorescent PCR is obviously better than that of conventional PCR, and it can be used to detect the clinical samples quickly and accurately, which provides technical support for the prevention and control of foreign epidemic diseases.
【作者單位】： 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心/國家牛病重點實驗室/重慶市進境陸生動物疫病防控研究工程中心;重慶大學生物工程學院;西南大學榮昌校區(qū);中國檢驗檢疫科學研究院;
【基金】：國家質檢公益性項目(201310093) 重慶市應用開發(fā)項目(CSTC2015yykf C8001) 國家十三五科研項目(2016YFD0500907-X)
【分類號】：S852.653

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本文編號：2151546