本文選題：FAM3A + 脂肪細(xì)胞分化　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：FAM3A是蛋白質(zhì)序列相似度為3的細(xì)胞因子家族成員之一,它在肝臟中受到PPARG調(diào)控,參與脂肪代謝。本實(shí)驗(yàn)旨在研究FAM3A在前體脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及其在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用。主要研究結(jié)果如下：1.在3T3L1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)C/EBPbeta,檢測(cè)FAM3A基因表達(dá)量變化,發(fā)現(xiàn)C/EBPbeta能促進(jìn)FAM3A表達(dá)(P0.01)。2.構(gòu)建FAM3A啟動(dòng)子缺失雙熒光報(bào)告載體D1(-1478/+46)、D2(-1187/+46)、D3 (-951/+46)、D4 (-442/+46)、D5 (-285/+46)和D6 (-32/+46),分別轉(zhuǎn)染3T3L1、C2C12和CHO三種細(xì)胞,檢測(cè)熒光活性,結(jié)果FAM3A啟動(dòng)子各缺失在三種細(xì)胞中都有活性且有相似活性趨勢(shì),D5(-285/+46)活性最高,D6(-32/+46)活性最低,只有基本啟動(dòng)子活性。由此推斷核心啟動(dòng)子位于-32bp至+46bp區(qū)域,-285bp至-32bp區(qū)域是啟動(dòng)子正向調(diào)控元件富集區(qū),而-1478bp至-285bp區(qū)域分布著較多的抑制啟動(dòng)子活性的元件。3.將C/EBPbeta真核表達(dá)載體與FAM3A啟動(dòng)子各缺失共轉(zhuǎn)染,FAM3A啟動(dòng)子各缺失活性顯著增強(qiáng)(P0.01),其中C/EBPbeta對(duì)缺失片斷D-118,7/+46的作用最顯著(P0.01),將D-1187／+46活性提高了3.55倍。繼續(xù)將啟動(dòng)子上C/EBPbeta結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變并與C/EBPbeta真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染3T3L1細(xì)胞,結(jié)果突變啟動(dòng)子活性幾乎不受C/EBPbeta影響。接著應(yīng)用EMSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明C/EBPbeta蛋白能與啟動(dòng)子上C/EBPbeta結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。4.構(gòu)建FAM3A真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染3T3L1細(xì)胞,用MDI誘導(dǎo)3T3L1細(xì)胞分化,結(jié)果該細(xì)胞成脂分化效率受到FAM3A抑制,分化8天后甘油三脂含量顯著降低。檢測(cè)脂肪分化標(biāo)志基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)同對(duì)照組相比,PPARG2和FABP4在FAM3A基因在細(xì)胞分化2天后表達(dá)量顯著下調(diào)(P0.05),C/EBPα/SCD1、 DGAT1、LPL和FABP4基因在分化8天后下調(diào)表達(dá),并達(dá)到顯著水平(P0.05)。FAM3A基因在3T3L1細(xì)胞分化8天后對(duì)HSL、ACC2、AdipoR1、FAS, ACOX1和UCP2基因表達(dá)沒有影響。5.將FAM3A真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染3T3L1細(xì)胞,72小時(shí)后收集細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞周期,結(jié)果實(shí)驗(yàn)組的G1期細(xì)胞數(shù)量從63.5%上升到72.7%,同時(shí)S期占的細(xì)胞比例從24.8%下降至18.3%,兩組細(xì)胞的G2期細(xì)胞數(shù)量沒有顯著差異,表明FAM3A能抑制3T3L1細(xì)胞周期。
[Abstract]:FAM3A is a member of cytokine family whose protein sequence similarity is 3. FAM3A is regulated by PPARG in liver and participates in fat metabolism. The aim of this study was to investigate the transcriptional mechanism of FAM3A in precursor adipocytes and its role in adipocyte differentiation. The main results are as follows: 1. The expression of FAM3A gene was detected in 3T3L1 cells. It was found that C / EBP beta could promote the expression of FAM3A (P0.01) .2. The double fluorescent report vector D1 (-1478 / 46) D 2 (-118787 / 46) D3 (-951 / 46) D4 (-442 / 46) D5 (-28546) and D6 (-32 / 46) were constructed and transfected into three kinds of cells, 3T3L1C2C12 and Cho, respectively. Results the deletion of FAM3A promoter had the highest activity of D5 (-285 / 46) and the lowest activity of D6 (-32 / 46) in all three kinds of cells. It is concluded that the core promoter is located in the region of -32bp to 46bp, the region of -285bp to -32bp is the rich region of the positive regulatory element of the promoter, while the region of -1478bp to -285bp distributes more elements that inhibit the promoter activity. The deletion activity of C / EBPbeta and FAM3A promoter was significantly increased (P0.01), and the activity of D-1187 / 46 was the most significant (P0.01). The activity of D-1187 / 46 was increased by 3.55 times. The C / EBP beta binding site on the promoter was continuously mutated and co-transfected with the C / EBPbeta eukaryotic expression vector into 3T3L1 cells. The results showed that the promoter activity was almost independent of C / EBP beta. Then the EMSA assay was used to further prove that the C / EBP beta protein could bind to the C / EBP beta binding site on the promoter. FAM3A eukaryotic expression vector was constructed and transfected into 3T3L1 cells. The differentiation of 3T3L1 cells was induced by MDI. As a result, the adipogenic differentiation efficiency of the cells was inhibited by FAM3A, and the triglyceride content decreased significantly after 8 days of differentiation. Compared with the control group, the expression of PPARG2 and FABP4 in FAM3A gene was significantly down-regulated 2 days after differentiation (P0.05), the expression of C / EBP 偽 / SCD1, DGAT1 / LPL and FABP4 genes were down-regulated 8 days after differentiation. FAM3A gene had no effect on the expression of HSLACC2AdipoR1 FASA, ACOX1 and UCP2 genes in 3T3L1 cells 8 days after differentiation. FAM3A eukaryotic expression vector was transfected into 3T3L1 cells for 72 hours. Results the number of G1 phase cells in the experimental group increased from 63.5% to 72.7%, while the percentage of S phase cells decreased from 24.8% to 18.3cells. There was no significant difference in the number of G2 phase cells between the two groups, which indicated that FAM3A could inhibit the cell cycle of 3T3L1 cells.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.2

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本文編號(hào)：2093613