本文選題：牛白細胞介素-2 + 牛分枝桿菌Ag85A�。� 參考：《揚州大學》2015年碩士論文

【摘要】：牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis, bTB)主要是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)等引起的一種重要的人獸共患傳染病。牛感染牛分枝桿菌后,主要誘導機體產(chǎn)生Thl型細胞免疫應答反應,其中白細胞介素-2是Thl型細胞免疫應答產(chǎn)生的主要細胞因子之一。牛白細胞介素-2(BoIL-2)是由特異性抗原或絲裂原刺激后,機體分泌的一種具有多種生物學活性的細胞因子,在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Ag85復合物是結(jié)核分枝桿菌一種主要的分泌蛋白,主要由三種分泌蛋白Ag85A、Ag85B和Ag85C組成。研究表明Ag85A可刺激機體產(chǎn)生Thl型細胞免疫應答,誘導IFN-γ、TNF-a和IL-2等細胞因子的分泌,是一種重要的免疫優(yōu)勢抗原。因此,本研究分別制備牛IL-2和牛分枝桿菌Ag85A的單克隆抗體,為牛結(jié)核病的預防與診斷等研究提供重要的生物材料。1.牛IL-2的原核表達及單克隆抗體的制備與鑒定從ConA刺激的健康奶牛外周血淋巴細胞中提取總RNA,應用RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板,并擴增429 bp大小的目的基因。隨后將目的基因分別與表達載體pET-30a(+)和pGEX-6p-1連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌,分別構(gòu)建pET-30a-BoIL-2/BL21 (DE3)和pGEX-6p-l-BoIL-2/BL21.對重組菌進行誘導表達后,SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示目的條帶大小分別為21 kDa和4l kDa,與預期大小相一致。Western Blot結(jié)果顯示其具有良好的免疫反應性。以純化融合蛋白rHis-BoIL-2免疫6周齡BALB/c小鼠,經(jīng)三次免疫后,采用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)進行細胞融合。以純化融合蛋白rGST-BoIL-2作為檢測原,采用間接ELISA方法檢測篩選陽性細胞克隆,經(jīng)2次亞克隆,獲得11株能穩(wěn)定分泌特異性BoIL-2單抗的雜交瘤細胞株,分別命名為1A3.1D3、2G7、 3C10、3D8、5D10、5F11、5G2、5G6、6D7和6E5。亞類鑒定結(jié)果顯示,除1A3和6E5亞類為IgG2b型,2G7亞類為IgG2a型,3C10和5G2亞類為IgG3型,其余6株單抗的亞類均為IgG1型。效價測定結(jié)果顯示,除3C10上清效價為1：2560,2G7和5G2的上清效價為1：5120外,其余細胞上清效價均在1.0×104以上,11株單抗腹水效價均在1.0×100-3.0×107之間。另外,11株單抗均與商品化大腸桿菌表達BoIL-2和畢赤酵母表達BoIL-2有較好的反應性。Western Blot結(jié)果顯示所獲得11株單抗均與融合蛋白rHis-BoIL-2和rGST-BoIL-2有反應,而與對照組pET-30a/BL21(DE3)和pGEX-6P-1/BL21空載體細菌不發(fā)生反應。特異性鑒定結(jié)果顯示11株單抗只與相應的融合蛋白有反應,與其它重組細胞因子均無交義反應。流式檢測結(jié)果顯示3D8、5D10、6D7和6E5四株單抗與天然BoIL-2具有較好的反應性。2.牛分枝桿菌Ag85A單克隆抗體的制備與鑒定以純化融合蛋白rGST-Ag85A作為免疫原,采用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)制備穩(wěn)定分泌牛分枝桿菌Ag85A抗體的雜交瘤細胞株。以純化融合蛋白rHis-Ag85A作為檢測原,采用間接ELISA檢測方法,篩選陽性細胞克隆,經(jīng)2次細胞亞克隆共獲得9株能穩(wěn)定分泌牛分枝桿菌Ag85A特異性單抗的雜交瘤細胞株,分別命名為1C6、2E6、2F2、3B8、3D9、4B3、 4F3、5B9和6B5。亞型鑒定和效價測定結(jié)果顯示,9株單抗均為IgG1型,腹水效價均在1.0×106-1.0×108之間,細胞上清效價均在1.0×104以上。Western Blot試驗和IFA試驗結(jié)果顯示,9株單抗均與原核表達rHis-Ag85A、rGST-Ag85A,真核表達GFP-Ag85A,以及rBCG::Ag85A和wtBCG細菌中Ag85A抗原都有較好的特異性反應,單抗3D9與真核表達GFP-Ag85B和GFP-Ag85C有反應,單抗4B3與真核表達GFP-Ag85C有反應。綜上所述,本研究共制備11株能穩(wěn)定分泌抗BoIL-2特異性單抗和9株穩(wěn)定分泌抗牛分枝桿菌Ag85A特異性單抗的雜交瘤細胞株。經(jīng)鑒定BoIL-2單抗和Ag85A單抗均具有識別相應天然抗原的活性,為牛結(jié)核病的檢測、診斷等研究提供了重要的生物材料。
[Abstract]:The recombinant plasmid pET - 30a - BoIL - 2 was amplified by indirect ELISA . The recombinant plasmid pET - 30a - BoIL - 2 was purified by indirect ELISA . In this study , 11 hybridoma cell strains secreting anti - BoIL - 2 - specific monoclonal antibodies and 9 stably secreting anti - bovine mycobacterium Ag85A - specific monoclonal antibodies were prepared . Both monoclonal antibodies and Ag85A monoclonal antibodies were used to identify the activity of the corresponding natural antigens , which provided important biological materials for the detection and diagnosis of bovine tuberculosis .
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.4

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本文編號：2088734