本文選題：單核細(xì)胞增生李斯特茵 + 轉(zhuǎn)錄譜　； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,簡(jiǎn)稱單增李斯特菌),為低G+C含量的革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌,能引起人和動(dòng)物的感染。該菌有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力,可以在高滲透壓(10-20%NaCl)、寬泛的溫度(0.4-45℃)和pH(2.5-9)條件下生長(zhǎng)。人因食用單增李斯特菌污染的食品而發(fā)生李斯特菌病,出現(xiàn)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎和孕婦流產(chǎn)等嚴(yán)重的病癥,死亡率高達(dá)30%。在自然環(huán)境、食品加工和儲(chǔ)存環(huán)境以及宿主胃腸道中存在各種不同的應(yīng)激,而成功抵抗這些應(yīng)激是單增李斯特菌在環(huán)境或食品中生存并建立感染的關(guān)鍵因素之一。作為單增李斯特菌中最重要的應(yīng)激調(diào)控因子,Sigma B (σ~B)對(duì)細(xì)菌能否在應(yīng)激環(huán)境中成功啟動(dòng)抗應(yīng)激基因的表達(dá)和生存至關(guān)重要。然而,aB能否在遭遇應(yīng)激時(shí)與RNA聚合酶結(jié)合形成全酶(RNAP)進(jìn)而啟動(dòng)相應(yīng)的抗應(yīng)激基因轉(zhuǎn)錄,并在應(yīng)激結(jié)束后及時(shí)將細(xì)菌調(diào)回低活力狀態(tài)從而降低能耗的過(guò)程亦受到其調(diào)控操縱子的精密調(diào)控。與枯草芽孢桿菌相類似,單增李斯特菌σ~B與其七個(gè)調(diào)控子(Regulator of Sigma B:rsbR, rsbS, rsbT, rsbU, rsbV, rsbW和rsbX)共表達(dá),這些調(diào)控操縱子主要通過(guò)磷酸化/去磷酸化作用來(lái)實(shí)現(xiàn)應(yīng)激調(diào)控。在該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,對(duì)啟動(dòng)應(yīng)激的機(jī)制研究較為深入：去磷酸化的RsbV競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RsbW, σ~B被釋放并與RNA聚合酶結(jié)合形成全酶；而應(yīng)激結(jié)束后,該系統(tǒng)是如何結(jié)束應(yīng)激模式,使細(xì)菌恢復(fù)至低活力狀態(tài)的過(guò)程卻鮮有研究報(bào)道。本研究旨在：(1)獲得攜帶σ~B啟動(dòng)子與gfp基因融合的報(bào)告質(zhì)粒,用于研究單增李斯特菌在應(yīng)激條件下σ~B活性；(2)應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探尋不同應(yīng)激條件下相關(guān)基因表達(dá)水平變化的特點(diǎn)；(3)探明單增李斯特菌RsbX在應(yīng)激過(guò)程中和生長(zhǎng)穩(wěn)定期對(duì)σ~B的調(diào)控作用。以pERL3為骨架,通過(guò)SOE-PCR技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶3個(gè)不同σ~B依賴型啟動(dòng)子與gfp融合的報(bào)告基因載體,并利用熒光酶標(biāo)儀分析攜帶這些載體的單增李斯特菌在酸或鹽應(yīng)激條件下的報(bào)告基因表達(dá)水平。結(jié)果表明,sigB自身啟動(dòng)子PsigB比P0880和P1602更為敏感,可準(zhǔn)確指示6B的活性；鹽應(yīng)激比酸應(yīng)激對(duì)σ~B的激活程度高；5%的NaCl濃度和30 min的應(yīng)激時(shí)間足以對(duì)6B產(chǎn)生顯著的激活效應(yīng)。該報(bào)告載體可用于應(yīng)激條件下σ~B激活機(jī)制的研究。運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)分別對(duì)經(jīng)過(guò)30 min酸應(yīng)激(pH4.8)、鹽應(yīng)激(5%NaCl)和過(guò)氧化氫應(yīng)激(5mMH2O2)的單增李斯特菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜分析,分別發(fā)現(xiàn)了26、29和55個(gè)顯著的差異表達(dá)基因(差異2倍,P值0.05)。GO分析顯示這些差異表達(dá)基因主要與代謝過(guò)程相關(guān)。PCA分析發(fā)現(xiàn)鹽應(yīng)激和過(guò)氧化氫應(yīng)激組表現(xiàn)出相類似的轉(zhuǎn)錄譜,且這兩個(gè)應(yīng)激組中也有更多相同的差異表達(dá)基因,提示鹽應(yīng)激和過(guò)氧化氫應(yīng)激對(duì)單增李斯特菌的激活方式相似或是細(xì)菌對(duì)這兩種應(yīng)激的耐受方式有著較為密切的聯(lián)系。而酸應(yīng)激組的轉(zhuǎn)錄譜和差異表達(dá)基因結(jié)果則顯示其作用相對(duì)獨(dú)立于其他兩種應(yīng)激。這些結(jié)果為后續(xù)應(yīng)激調(diào)控機(jī)制研究提供了參考。RsbX是σ~B調(diào)控子中相對(duì)獨(dú)立的一個(gè),枯草芽孢桿菌RsbX被認(rèn)為是σ~B調(diào)控子中唯一的負(fù)調(diào)控因子。本研究中,我們通過(guò)基因缺失和回補(bǔ)技術(shù),發(fā)現(xiàn)rsbX基因的缺失并不影響單增李斯特菌在pH 4.8或5%NaCl應(yīng)激培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力,且rsbX基因缺失株在高鹽應(yīng)激(15%NaCl)培養(yǎng)基和交叉應(yīng)激試驗(yàn)中的存活率與野生株相比均無(wú)差異。由此,我們認(rèn)為rsbX基因不直接介導(dǎo)單增李斯特菌的抗應(yīng)激能力。分子水平的檢測(cè)也顯示經(jīng)過(guò)0.5 h的5%NaCl應(yīng)激,rsbX基因缺失株與野生株的σ~B轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均無(wú)顯著差異,表明RsbX的缺失不影響應(yīng)激誘導(dǎo)的σ~B激活。為了探究RsbX在李斯特菌抗應(yīng)激中的作用,我們?cè)O(shè)計(jì)了應(yīng)激-恢復(fù)生長(zhǎng)-再應(yīng)激試驗(yàn)。rsbX基因缺失株在恢復(fù)生長(zhǎng)0.5 h-1.5 h后抵抗二次應(yīng)激的能力顯著高于野生株。經(jīng)RT-PCR、啟動(dòng)子活性檢測(cè)以及Western blot證實(shí),rsbX基因缺失株這種二次應(yīng)激存活率提高得益于恢復(fù)生長(zhǎng)階段顯著升高的σ~B表達(dá)水平(高于野生株),表明RsbX在應(yīng)激后恢復(fù)期負(fù)調(diào)控σ~B,將其從高活力狀態(tài)下調(diào)至正常水平。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)sigB基因缺失株在應(yīng)激后恢復(fù)生長(zhǎng)階段的ATP水平顯著高于野生株,而rsbX基因缺失株的ATP水平則顯著低于野生株和sigB基因缺失株,表明σ~B介導(dǎo)的應(yīng)激調(diào)控過(guò)程可能涉及細(xì)菌的能量消耗。比較了rsbX基因缺失株和野生型菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期培養(yǎng)物對(duì)高鹽應(yīng)激的差異,我們發(fā)現(xiàn)rsbX基因缺失不影響對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌對(duì)15%NaCl應(yīng)激培養(yǎng)基的存活率,但rsbX基因缺失株平臺(tái)期培養(yǎng)物對(duì)高鹽應(yīng)激的存活率顯著高于野生株。平臺(tái)期rsbX基因缺失株的6B表達(dá)水平也顯著高于野生株,表明RsbX對(duì)σ~B的負(fù)調(diào)控作用不僅體現(xiàn)在應(yīng)激后恢復(fù)期,也表現(xiàn)在細(xì)菌生長(zhǎng)平臺(tái)期。綜上所述,本研究構(gòu)建了可準(zhǔn)確指示σ~B活性的報(bào)告載體；證明了RsbX為單增李斯特菌σ~B的負(fù)調(diào)控因子,且該負(fù)調(diào)控作用表現(xiàn)在應(yīng)激后恢復(fù)期和生長(zhǎng)平臺(tái)期；發(fā)現(xiàn)了單增李斯特菌10403S在酸應(yīng)激、鹽應(yīng)激和過(guò)氧化氫應(yīng)激中的差異表達(dá)基因以及不同應(yīng)激間可能存在的聯(lián)系；該研究結(jié)果為進(jìn)一步探究單增李斯特菌的應(yīng)激調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:It is a key factor in the environment , food processing and storage environment and pH value ( 2.5 -9 ) .
The aim of this study was to : ( 1 ) to obtain a report plasmid carrying 蟽 ~ B promoter and gfp gene fusion to study 蟽 ~ B activity under stress condition ;
( 2 ) To explore the characteristics of gene expression level changes under different stress conditions by using transcriptome technique ;
( 3 ) A reporter gene vector carrying three different sigma - B - dependent promoters and gfp fusion was successfully constructed by SOE - PCR using pERL3 as the backbone , and the expression level of reporter gene carrying three different 蟽 ~ B - dependent promoters and gfp was successfully constructed by SOE - PCR . The results showed that the PsigB promoter was more sensitive to P0880 and P1602 than P0880 and P1602 , and could accurately indicate the activity of 6B .
Salt stress is higher than that of acid stress on 蟽 ~ B ;
In this study , we found that the deletion of rsbX gene was similar to that of wild strain . The results showed that the deletion of rsbX gene was similar to that of wild strain .
The negative regulation factor of RsbX was proved to be a single increase of 蟽 ~ B , and the negative regulation appeared in the post - stress recovery period and the growth stage .
It was found that the differential expression of 10403S in acid stress , salt stress and hydrogen peroxide stress and the possible association between different stresses were found .
The results of this study provide a basis for further exploring the mechanism of stress control in single listeride .
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：2066590