本文選題：滅活H9N2禽流感病毒 + 樹突狀細(xì)胞��； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：禽流感病毒的廣泛傳播不僅給世界各國的養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也加劇了新型流感爆發(fā)的風(fēng)險。禽流感病毒除了可以通過呼吸道傳播外,還可以在水禽的消化道內(nèi)復(fù)制并通過糞便向外不斷排毒�？诜呙缈梢栽谙鲤つそ⒚庖叻谰�,直接切斷病毒的傳播路徑。盡管滅活禽流感病毒作為口服疫苗的候選抗原,較減毒活疫苗相比,具有較好的安全性,但是應(yīng)用單獨(dú)抗原進(jìn)行免疫,免疫效果往往不理想。此外,在口服免疫途徑中,腸道黏膜屏障是影響抗原跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的一個不可忽略的關(guān)鍵因素,再加之滅活病毒的復(fù)制性喪失,導(dǎo)致黏膜下樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)捕獲的抗原數(shù)量急劇減少,對啟動下游抗原特異性免疫應(yīng)答非常不利。CpGs是一種安全有效的黏膜免疫增強(qiáng)劑。本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn),CpGs配合滅活H9N2禽流感病毒(H9N2 whole inactivated influenza viruses,H9N2 WIV)口服免疫鴨可以顯著增強(qiáng)局部黏膜和全身系統(tǒng)免疫應(yīng)答水平。那么,CpGs除了可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的天然免疫外,是否在H9N2 WIV的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。因此,本研究首先確證了CpGs配合H9N2 WIV口服免疫后對小鼠局部黏膜和全身系統(tǒng)免疫應(yīng)答水平的影響。其次,在體外試驗(yàn)中應(yīng)用樹突狀細(xì)胞/腸上皮細(xì)胞(DC/Caco-2)共培養(yǎng)模型,在體內(nèi)試驗(yàn)中應(yīng)用腸道原位結(jié)扎灌注模型,深入剖析了CpGs在H9N2 WIV跨消化道上皮轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮的作用。最后,在黏膜下DCs成功捕獲抗原后,進(jìn)一步探討了DCs表型和功能成熟的情況。本研究內(nèi)容具體分為以下三個部分:1、CpGs配合滅活H9N2禽流感病毒口服免疫對小鼠局部黏膜和全身系統(tǒng)免疫應(yīng)答水平的影響本試驗(yàn)應(yīng)用CpGs配合滅活H9N2禽流感病毒口服免疫小鼠,首先通過檢測腸道、氣管和肺涮洗液中特異性IgA抗體水平探討CpGs配合H9N2 WIV口服免疫對局部黏膜免疫水平的影響。其次,通過檢測血清特異性IgG及其亞型抗體水平、HI中和抗體水平、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟淋巴細(xì)胞的活化和增殖情況、脾臟淋巴細(xì)胞亞群變化,探討CpGs配合H9N2 WIV口服免疫對機(jī)體全身系統(tǒng)免疫應(yīng)答水平的影響。結(jié)果顯示:首免后28天,與單獨(dú)H9N2 WIV免疫組相比,在CpGs配合H9N2 WIV口服免疫組中,腸道、氣管和肺涮洗液中特異性IgA抗體水平顯著提升;在全身系統(tǒng)免疫中,血清特異性IgG、IgG1、IgG2a/c抗體水平和HI水平顯著提高,脾淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+T細(xì)胞的比例明顯上調(diào);當(dāng)抗原再次刺激時,腸系膜淋巴結(jié)和脾臟淋巴細(xì)胞活化標(biāo)志CD69的表達(dá)顯著上調(diào)、淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明:CpGs配合H9N2 WIV口服免疫小鼠,可以顯著提高局部消化道黏膜和全身系統(tǒng)免疫應(yīng)答水平。2、CpGs對樹突狀細(xì)胞跨消化道黏膜上皮攝取滅活H9N2禽流感病毒能力的影響在體外試驗(yàn)中,建立DC/Caco-2共培養(yǎng)模型,在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中,建立腸道原位結(jié)扎灌注模型,應(yīng)用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù),深入探討了CpGs是否有助于H9N2 WIV的跨消化道上皮轉(zhuǎn)運(yùn)。結(jié)果顯示:CpGs配合H9N2 WIV能夠募集更多的DCs聚集在腸上皮下方,形成跨上皮樹突(Transepithelial dendrites,TEDs),這些樹突可以攝取腸腔中的H9N2 WIV和CpGs。這個過程并不依賴上皮的轉(zhuǎn)胞吞方式和上皮屏障的破壞。此外,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CD103+和CD103-兩種腸黏膜DCs亞型是這個過程的重要參與者。其中,攝取病毒粒子的CD103+ DCs可以在2 h內(nèi)快速遷移至腸系膜淋巴結(jié)并參與抗原遞呈。在回腸和空腸處,DCs募集和TEDs的形成更易發(fā)現(xiàn),而在派爾氏斑(Peyer's patches,PPs)處,CpGs更有利于DCs向上皮下圓頂區(qū)聚集,而TEDs卻非常少見。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CpGs配合H9N2 WIV可以顯著促進(jìn)消化道上皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子CCL20,進(jìn)而募集更多的DCs在黏膜下聚集。CCL20在上皮細(xì)胞游離側(cè)分布的方式,也為TEDs的形成提供了可能。結(jié)果表明:CpGs通過刺激腸上皮細(xì)胞分泌CCL20,募集DCs至腸黏膜下并形成TEDs,進(jìn)而加強(qiáng)H9N2 WIV的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn),這可能是引起下游有效的抗原特異性免疫應(yīng)答的一個重要機(jī)制。3、CpGs配合滅活H9N2禽流感病毒對消化道黏膜樹突狀細(xì)胞成熟能力的影響?zhàn)つは翫Cs攝取抗原后,將快速轉(zhuǎn)變狀態(tài),由未成熟轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒鞝顟B(tài),以便下游的抗原遞呈過程。因此,本研究中,在體外DC/Caco-2共培養(yǎng)模型中,通過檢測黏膜下DCs的表型標(biāo)志表達(dá)、細(xì)胞因子分泌和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力,評價CpGs配合H9N2 WIV對黏膜下DCs成熟功能轉(zhuǎn)變的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在共培養(yǎng)系統(tǒng)的游離側(cè)接種CpGs和H9N2 WIV并作用24 h后,與培養(yǎng)基對照組相比,顯著上調(diào)DCs表型標(biāo)志CD40、CD80、CD86和MHCⅡ的表達(dá);同時,強(qiáng)烈刺激DCs分泌IL-10、IL-12p70和IL-23;混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)中,在DC:T=1:1和1:5兩種細(xì)胞比例下,CD4+T細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明:在體外DC/Caco-2共培養(yǎng)模型中,CpGs配合H9N2 WIV可以有效地增強(qiáng)黏膜下DCs的成熟能力,這對下游獲得性免疫應(yīng)答的啟動具有重要作用。
[Abstract]:The spread of avian influenza virus has not only caused huge economic losses to poultry industry in the world, but also increased the risk of a new outbreak of influenza. In addition to the respiratory tract, the avian influenza virus can also be replicated in the digestive tract of waterfowl and can not be detoxicated through feces. In spite of the inactivation of the avian influenza virus as the candidate antigen of the oral vaccine, it has a better safety than the live attenuated vaccine, but the immune effect is often not ideal with the use of individual antigens. In addition, the intestinal mucosal barrier in the oral immune pathway affects the antigen span. A key factor that can not be ignored in skin transport, and the replication loss of inactivated virus, resulting in a sharp decrease in the number of antigens captured by the submucosal dendritic cells (Dendritic cells, DCs) and a very effective mucosal immune enhancement agent for the initiation of the specific immune response to the downstream antigen is a safe and effective mucosal immune enhancement agent. It was found that CpGs combined with inactivated H9N2 avian influenza virus (H9N2 whole inactivated influenza viruses, H9N2 WIV) oral immune ducks could significantly enhance the level of local mucosal and systemic immune responses. In addition, CpGs can play an important role in the trans epithelial transport of H9N2 WIV, in addition to promoting the natural immunity of immune cells. This study first confirmed the effect of CpGs combined with H9N2 WIV on the local mucosal and systemic immune response level in mice. Secondly, in vitro, the co culture model of dendritic cells / intestinal epithelial cells (DC/Caco-2) was used in the experiment, and the intestinal ligation perfusion model was used in the experiment in vivo, and CpGs was deeply analyzed in H9N2 WIV. Finally, after the submucosal DCs successfully captured the antigen, the DCs phenotype and functional maturity were further investigated. The content of this study was divided into three parts: 1, CpGs combined with inactivated H9N2 avian influenza virus oral immune response to local mucosal and systemic immune responses in rats The effect of CpGs combined with inactivated H9N2 avian influenza virus in mice was studied. First, the effects of CpGs and H9N2 WIV on the level of local mucosal immunity were investigated by detecting the specific IgA antibody level in the intestinal tract, trachea and lung rinse. Secondly, the serum specific IgG and its subtype antibody level, HI neutralizing antibody were detected. Levels, activation and proliferation of mesenteric lymph nodes and splenic lymphocytes, changes in lymphocyte subsets of the spleen and the effect of CpGs combined with H9N2 WIV oral immunization on systemic systemic immune response. The results showed that 28 days after the first immunization, compared with the single H9N2 WIV immunization group, the intestine and gas in the CpGs combined with the H9N2 WIV oral immune group. The level of specific IgA antibody in the tube and lung rinse fluid increased significantly. In systemic systemic immunization, the serum specific IgG, IgG1, IgG2a/c antibody level and HI level were significantly increased, and the proportion of CD3+CD4+T cells in the splenic lymphocyte was obviously up-regulated. When the antigen was stimulated again, the expression of the mesenteric lymph node and spleen lymphocyte activation marker CD69 expression was obvious. The proliferation ability of lymphocytes was significantly enhanced. The results showed that CpGs combined with H9N2 WIV in mice could significantly improve the local digestive tract mucosa and systemic immune response level.2. CpGs has an effect on the ability of dendritic cells to intake the ability to intake H9N2 avian influenza virus in the epithelium of the digestive tract and to establish DC/Caco in vitro. The -2 co culture model, in the mice test, established the intestinal ligation perfusion model, applied confocal microscopy and flow cytometry to explore whether CpGs helped H9N2 WIV translocation in the trans alimentary tract. The results showed that CpGs combined with H9N2 WIV could raise more DCs to accumulate below the intestinal epithelium and form trans epithelial dendrites (T). Ransepithelial dendrites, TEDs), these dendrites can absorb the H9N2 WIV and CpGs. in the intestinal cavity, which does not depend on the epitheliocytosis and the destruction of the epithelial barrier. Furthermore, the DCs subtypes of the two intestinal mucosa of the CD103+ and CD103- are an important participant in this process. Among them, CD103+ DCs for the uptake of viral particles can be 2. H is rapidly migrated to the mesenteric lymph nodes and participates in antigen presentation. In the ileum and jejunum, DCs recruitment and the formation of TEDs are more easily found, while in Peyer's patches (PPs), CpGs is more conducive to the aggregation of DCs to the upper subcutaneous dome, but TEDs is very rare. Further studies have found that CpGs with H9N2 WIV can significantly promote digestion. The expression of chemokine CCL20 in the epithelial cells and further recruitment of more DCs in submucosal aggregation of.CCL20 in the free side of epithelial cells also provides a possibility for the formation of TEDs. The results show that CpGs enhances the secretion of CCL20 by stimulating the intestinal epithelial cells, raising DCs to the intestinal mucosa and forming TEDs, and thus enhancing the trans epithelial transport of H9N2 WIV. It may be an important mechanism to induce the effective antigen specific immune response in the downstream,.3, and CpGs combined with the inactivation of H9N2 avian influenza virus to the maturation of the dendritic cells in the digestive tract. After the submucosal DCs uptake antigen, it will change rapidly from immature to mature, so that the downstream antigen presentation process. In the study, in the in vitro DC/Caco-2 co culture model, by detecting the phenotype markers expression of submucosal DCs, cytokine secretion and mixed lymphocyte reaction ability, the changes of CpGs and H9N2 WIV on submucosal DCs maturation were evaluated. The results showed that the free side of the co culture system was inoculated with CpGs and H9N2 WIV and the action of 24 h. Compared with the control group, the expression of DCs phenotype marked CD40, CD80, CD86 and MHC II, and DCs secretion of IL-10, IL-12p70 and IL-23; in mixed lymphocyte reaction test, the proliferation ability of CD4+T cells increased significantly under the ratio of DC:T=1:1 and 1:5 two cells. H9N2 WIV can effectively enhance the maturation ability of submucosal DCs, which plays an important role in the initiation of downstream immune response.
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2060960