本文選題：馬傳染性貧血病毒 + p26蛋白�。� 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：馬傳染性貧血(Equine infectious anemia,EIA)是一種能夠感染馬、驢和斑馬等馬屬動(dòng)物的動(dòng)物性傳染病。它能夠引起馬屬動(dòng)物貧血、血小板減少、發(fā)熱、消瘦和多器官衰竭等癥狀。EIA由Ligné于1843年在法國首次發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已在美洲、歐洲、中東和南非等世界范圍都有流行,使當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè),賽馬業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失。解放前期,我國也曾出現(xiàn)EIA流行,但在20世紀(jì)70-80年代由于沈榮顯等人研制出EIAV弱毒疫苗,從而使疫病得到有效控制。馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是引起EIA的病原體。EIAV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒,同其他慢病毒如人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)和貓免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus)類似,EIAV包含有Gag、Pol和Env 3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)蛋白和Tat、Rev和S2 3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。Gag蛋白作為多聚蛋白,最終可以剪切為基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)、核衣殼蛋白(NC)和p9蛋白,這些蛋白都作為病毒粒子結(jié)構(gòu)的一部分而存在。EIAV衣殼蛋白又稱為p26蛋白,它的主要功能是自我組裝形成病毒的衣殼結(jié)構(gòu),其構(gòu)成的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)包裹EIAV的基因組以確保病毒的有效復(fù)制。同時(shí)作為病毒感染過程中的主要免疫原性蛋白,p26在不同EIAV株的結(jié)構(gòu)與功能高度保守。并且p26蛋白也是病毒粒子中豐度最高的蛋白之一。本研究通過實(shí)驗(yàn)室制備的2株EIAV p26單克隆抗體:MAb 1G11和MAb 9H8,利用肽掃描技術(shù),最終通過免疫印跡試驗(yàn)(western blot)鑒定出MAb 1G11和MAb 9H8所針對(duì)p26蛋白的線性表位。MAb 1G11針對(duì)p26蛋白C端的20個(gè)氨基酸:199KNAMRHLRPEDTLEEKMYAC218;MAb 9H8則針對(duì)N端的8個(gè)氨基酸:73NLDKIAEE80。這對(duì)于分析p26蛋白結(jié)構(gòu)與功能以及以表位為基礎(chǔ)建立診斷方法提供了依據(jù),也對(duì)基于表位的疫苗設(shè)計(jì)具有指導(dǎo)意義。在國務(wù)院頒布的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》中,明確指出要對(duì)EIA開展持續(xù)監(jiān)測,對(duì)經(jīng)濟(jì)娛樂用馬以及高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域的馬屬動(dòng)物進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測,從而加快推進(jìn)馬傳染性貧血消滅行動(dòng)。根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際和國家發(fā)展綱要,建立快速有效的診斷EIA的方法顯得尤為迫切與重要。傳統(tǒng)檢測EIAV的方法是利用p26蛋白檢測EIAV抗體的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agar gel immunodiffusion,AGID),又稱為Coggins試驗(yàn)。盡管AGID在檢測EIAV高度特異,但是缺乏敏感性。這對(duì)于檢測處于慢性期和非明顯期的臨床癥狀的EIA感染尤為不利。同時(shí)只能通過肉眼觀察抗原抗體結(jié)合的沉淀線粗細(xì)來對(duì)EIAV含量進(jìn)行粗略判斷,并無法對(duì)病毒進(jìn)行定量分析。再次,由于試驗(yàn)周期較長,無法對(duì)疾病進(jìn)行快速診斷,使得在生產(chǎn)實(shí)踐無法對(duì)疫情做到及時(shí)有效防控。本研究所鑒定的線性表位分別針對(duì)p26蛋白的N端與C端。其所針對(duì)的差異表位特性,為本實(shí)驗(yàn)建立抗原捕獲ELISA(Antigen Capture-ELISA,AC-ELISA)提供了可能。因此通過利用EIAV(CMV 3-8)感染性克隆或重組p26蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原,以MAb 1G11和MAb 9H8分別作為捕獲抗體和酶標(biāo)檢測抗體,建立以檢測EIAV的AC-ELISA方法。該方法也可以對(duì)病毒進(jìn)行定量,這也為研究病毒復(fù)制與其他相關(guān)生活周期病毒含量變化,以及EIAV與宿主限制因子(host restriction factors)如TRIM5α,APOBEC3家族和Tetherin相互拮抗作用提供了定量分析平臺(tái)。綜上,本研究利用針對(duì)EIAV p26蛋白的兩株單克隆抗體MAb 1G11和MAb 9H8,利用肽掃描技術(shù)鑒定出p26蛋白在蛋白N端與C端的線性表位;同時(shí)利用MAb 1G11和MAb 9H8識(shí)別p26蛋白表位的差異性,建立針對(duì)不同EIAV病毒株的AC-ELISA方法。已鑒定的線性表位可以為研究p26蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及基于表位建立檢測和設(shè)計(jì)表位疫苗提供依據(jù);通過建立的AC-ELISA方法不僅可以應(yīng)用于臨床樣品檢測及相關(guān)生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用,同時(shí)也可以通過病毒定量分析為深入研究病毒本身及病毒-宿主相互作用提供方法學(xué)平臺(tái)。
[Abstract]:Equine infectious anemia (EIA) is an animal infectious disease that can infect horses, donkeys and zebra and other equine animals. It can cause anemia, thrombocytopenia, fever, emaciation and multiple organ failure of the horse..EIA was first discovered in France in France in 1843, and is now in America, Europe, Middle East and South Africa. The world has been popular, making the local animal husbandry, horse racing and related industries suffer huge economic losses. In the early period of liberation, our country also appeared EIA popular, but in the 70-80 years of twentieth Century, the EIAV vaccine was developed by Shen Rongxian et al. So that the epidemic disease was effectively controlled. Equine infectious anemia virus (EIA), EIA V) is the pathogen.EIAV that causes EIA, which belongs to the retrovirus family, similar to other lentiviruses such as the human immunodeficiency virus (Human immunodeficiency virus, HIV), the monkey immunodeficiency virus (Simian immunodeficiency virus, SIV), and the cat immunodeficiency virus (Feline). The structure protein and the 3 non structural protein.Gag proteins, Tat, Rev and S2, as polyproteins, can eventually be cut into matrix protein (MA), capsid protein (CA), nucleocapsid protein (NC) and P9 protein. These proteins all exist as part of the structure of the virus particles and exist in the.EIAV capsid protein, also known as P26 protein. The main function of these proteins is self assembly. The capsid structure of the virus forms the structure of the topology that encapsulate the genome of EIAV to ensure the effective replication of the virus. At the same time, as the main immunogenic protein in the virus infection process, P26 is highly conserved in the structure and function of different EIAV strains. And the P26 protein is also one of the most abundant proteins in the virus particles. 2 EIAV P26 monoclonal antibodies, MAb 1G11 and MAb 9H8, were prepared by the peptide scanning technique. Finally, the linear epitopes of MAb 1G11 and MAb 9H8 were identified by the immunoblotting test (Western blot). Acid: 73NLDKIAEE80. provides a basis for the analysis of the structure and function of P26 protein and the establishment of a diagnostic method based on the epitopes. It also has a guiding significance for the design of the epitope based vaccine. In the national long-term animal epidemic prevention and control plan issued by the State Council (2012 to 2020), it is clearly pointed out that the sustainable monitoring of EIA is to be carried out, and the economy is on the economy. It is very urgent and important to establish a rapid and effective method for the diagnosis of EIA based on production practice and national development program. The traditional method for detecting EIAV is to detect the agar diffusion of EIAV antibodies by using P26 protein. The test (Agar gel immunodiffusion, AGID), also known as the Coggins test. Although AGID is highly specific in the detection of EIAV, it lacks sensitivity. This is especially bad for the detection of EIA infection in chronic and non obvious clinical symptoms. At the same time, the content of EIAV is rough by observing the precipitate line of antigen anti body binding by the naked eye. It is impossible to make a quantitative analysis of the virus. Again, because of the long test cycle, it is impossible to quickly diagnose the disease, which makes it impossible to prevent and control the epidemic in time and effectively. The linear epitopes identified in this study are directed against the N and C ends of the P26 protein. It is possible to capture ELISA (Antigen Capture-ELISA, AC-ELISA). Therefore, by using EIAV (CMV 3-8) infectious clones or recombinant P26 proteins as standard antigens, MAb 1G11 and MAb 9H8 are used as capture antibodies and enzyme labeled antibodies to detect EIAV. This method can also be used to quantify the virus, which is also studied. To investigate the changes in virus replication and other related life cycle viruses, and the mutual antagonism of EIAV and host restriction factors, such as TRIM5 alpha, APOBEC3 family and Tetherin, a quantitative analysis platform is provided. In this study, this study uses two monoclonal antibodies against EIAV P26 protein MAb 1G11 and MAb purposes, using peptide scanning. The technique identified the linear epitopes of P26 protein at the N end and the C end, and the identification of P26 protein epitopes by MAb 1G11 and MAb 9H8 to establish AC-ELISA methods for different EIAV virus strains. The identified linear epitopes can provide the basis for the study of the structure and function of P26 protein and the establishment of detection and design of epitope vaccines based on the epitopes. The AC-ELISA method, which is established, can be used not only in clinical sample detection and related production practice, but also by quantitative analysis of virus to provide a methodological platform for the in-depth study of virus and virus host interaction.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2051956