本文選題：鴨短喙侏儒綜合征 + 新型鴨細(xì)小病毒�。� 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：2014年以來(lái),中國(guó)東部許多肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了一種新的鴨病毒性傳染病,臨床上主要表現(xiàn)為雛鴨生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,上下喙萎縮,鴨舌頭腫大外伸,行走困難。暫命名為鴨短喙侏儒綜合癥(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)。該病病死率很低,但發(fā)病率10%~30%,部分鴨群發(fā)病率達(dá)到50%。給養(yǎng)鴨業(yè)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于這是一種在我國(guó)新出現(xiàn)的鴨傳染病,其致病病原尚不清楚,更缺乏有效的疫苗或治療性藥物。為此,本研究對(duì)采自安徽省碭山縣某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病鴨的病料進(jìn)行了病原分離和鑒定,同時(shí)還對(duì)其全基因組序列進(jìn)行了克隆和測(cè)序,此外我們還利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中嘗試表達(dá)了病原的結(jié)構(gòu)蛋白,為進(jìn)一步研制新型疫苗或藥物奠定基礎(chǔ)。首先,對(duì)碭山發(fā)病鴨實(shí)質(zhì)臟器進(jìn)行了RT-PCR/PCR檢測(cè),在排除其他常見(jiàn)鴨病毒性傳染病病原的前提下,初步確定該病病原為新型鴨細(xì)小病毒(Novel duck parvovirus,NDPV)。然后,將組織研磨液接種SPF鴨胚,盲傳3代后鴨胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡。在鴨胚尿囊液中檢測(cè)到了新型鴨細(xì)小病毒,其病毒滴度(ELD50)為10-4.2/0.2mL。將感染鴨胚的尿囊液進(jìn)行濃縮和純化,在掃描電鏡下可見(jiàn)直徑20nm左右,正二十面體病毒粒子。用病毒液感染1日齡雛鴨,可復(fù)制出與臨床癥狀相似的鴨短喙侏儒癥狀,進(jìn)一步證實(shí)分離的鴨細(xì)小病毒是造成鴨短喙侏儒綜合癥的關(guān)鍵性病原。參照Genbank登錄的鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)B株的基因序列,我們?cè)O(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物,對(duì)NDPV DS15株的全基因序列進(jìn)行了分段擴(kuò)增。試驗(yàn)結(jié)果顯示,NDPV DS15株病毒基因組全長(zhǎng)5104nt,結(jié)構(gòu)與鵝細(xì)小病毒相似,兩端為ITR,中間為兩個(gè)大開(kāi)放閱讀框。與其他水禽細(xì)小病毒進(jìn)行全基因組同源性比對(duì),分析結(jié)果顯示DS15株與鴨短喙侏儒癥分離株GPV SDLC01同源性最高,達(dá)到99.8%,與其他GPV同源性在92.6%~97.2%之間,與番鴨細(xì)小病毒(Muscovy parvovirus,MDPV)同源性在81.2%~85.4%之間。DS15株NS1蛋白和VP1蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果顯示,與傳統(tǒng)的GPV相比,我們分離到的NDPV DS15株和其他幾株鴨短喙侏儒癥分離株在NS1和VP1蛋白氨基酸水平具有極高相似性,氨基酸突變情況基本相同。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示,水禽細(xì)小病毒分為GPV和MDPV兩大分支,DS15株與其他幾個(gè)SBDS分離株處于GPV分支且單獨(dú)形成一個(gè)小分支。為了制備檢測(cè)NDPV的多克隆抗體,本文用PCR法擴(kuò)增NDPV的VP3基因,克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組VP3蛋白,然后利用包涵體純化方法純化重組VP3蛋白,免疫試驗(yàn)兔獲得多克隆抗體。Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明,該抗體能與重組的NDPV VP3蛋白及自然感染的NDPV發(fā)生反應(yīng),證明制備的抗體具有良好的抗原反應(yīng)性。為給研發(fā)抗NDPV感染的亞單位疫苗提供候選抗原,我們用PCR方法擴(kuò)增了DS15株VP2基因,然后將其插入供體質(zhì)粒pFastBacHTA中,構(gòu)建重組pFastBacHTA-VP2供體質(zhì)粒。再轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-HTA-VP2。用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞,48h后分別用間接免疫熒光和Western blot試驗(yàn)檢測(cè)靶基因的表達(dá)。結(jié)果表明我們?cè)趕f9細(xì)胞中成功表達(dá)出VP2蛋白,電鏡負(fù)染結(jié)果進(jìn)一步證明,所表達(dá)的重組VP2蛋白能夠在昆蟲(chóng)細(xì)胞中自我組裝形成病毒樣顆粒。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的病毒樣顆粒具有良好免疫原性。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步研制NDPV診斷抗原和病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Since 2014 , there has been a new duck viral infectious disease in many duck farms in eastern China , which is mainly characterized by slow growth and development of ducklings , atrophy of upper and lower beaks , enlargement of the tongue of the duck tongue , and difficulty in walking . The morbidity of the disease is very low , but the incidence rate is 10 % 锝，

本文編號(hào)：2036268