本文選題：鴨短喙侏儒綜合征 + 新型鴨細小病毒　； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學》2017年碩士論文

【摘要】：2014年以來,中國東部許多肉鴨養(yǎng)殖場發(fā)生了一種新的鴨病毒性傳染病,臨床上主要表現(xiàn)為雛鴨生長發(fā)育遲緩,上下喙萎縮,鴨舌頭腫大外伸,行走困難。暫命名為鴨短喙侏儒綜合癥(Short beak and dwarfism syndrome,SBDS)。該病病死率很低,但發(fā)病率10%~30%,部分鴨群發(fā)病率達到50%。給養(yǎng)鴨業(yè)造成較為嚴重的經(jīng)濟損失。由于這是一種在我國新出現(xiàn)的鴨傳染病,其致病病原尚不清楚,更缺乏有效的疫苗或治療性藥物。為此,本研究對采自安徽省碭山縣某養(yǎng)殖場發(fā)病鴨的病料進行了病原分離和鑒定,同時還對其全基因組序列進行了克隆和測序,此外我們還利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲細胞中嘗試表達了病原的結構蛋白,為進一步研制新型疫苗或藥物奠定基礎。首先,對碭山發(fā)病鴨實質(zhì)臟器進行了RT-PCR/PCR檢測,在排除其他常見鴨病毒性傳染病病原的前提下,初步確定該病病原為新型鴨細小病毒(Novel duck parvovirus,NDPV)。然后,將組織研磨液接種SPF鴨胚,盲傳3代后鴨胚出現(xiàn)規(guī)律性死亡。在鴨胚尿囊液中檢測到了新型鴨細小病毒,其病毒滴度(ELD50)為10-4.2/0.2mL。將感染鴨胚的尿囊液進行濃縮和純化,在掃描電鏡下可見直徑20nm左右,正二十面體病毒粒子。用病毒液感染1日齡雛鴨,可復制出與臨床癥狀相似的鴨短喙侏儒癥狀,進一步證實分離的鴨細小病毒是造成鴨短喙侏儒綜合癥的關鍵性病原。參照Genbank登錄的鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)B株的基因序列,我們設計了6對特異性引物,對NDPV DS15株的全基因序列進行了分段擴增。試驗結果顯示,NDPV DS15株病毒基因組全長5104nt,結構與鵝細小病毒相似,兩端為ITR,中間為兩個大開放閱讀框。與其他水禽細小病毒進行全基因組同源性比對,分析結果顯示DS15株與鴨短喙侏儒癥分離株GPV SDLC01同源性最高,達到99.8%,與其他GPV同源性在92.6%~97.2%之間,與番鴨細小病毒(Muscovy parvovirus,MDPV)同源性在81.2%~85.4%之間。DS15株NS1蛋白和VP1蛋白的氨基酸序列分析結果顯示,與傳統(tǒng)的GPV相比,我們分離到的NDPV DS15株和其他幾株鴨短喙侏儒癥分離株在NS1和VP1蛋白氨基酸水平具有極高相似性,氨基酸突變情況基本相同。系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示,水禽細小病毒分為GPV和MDPV兩大分支,DS15株與其他幾個SBDS分離株處于GPV分支且單獨形成一個小分支。為了制備檢測NDPV的多克隆抗體,本文用PCR法擴增NDPV的VP3基因,克隆至原核表達載體pGEX-4T-1中,轉化大腸桿菌BL21菌株,以IPTG誘導表達重組VP3蛋白,然后利用包涵體純化方法純化重組VP3蛋白,免疫試驗兔獲得多克隆抗體。Western-blot檢測結果表明,該抗體能與重組的NDPV VP3蛋白及自然感染的NDPV發(fā)生反應,證明制備的抗體具有良好的抗原反應性。為給研發(fā)抗NDPV感染的亞單位疫苗提供候選抗原,我們用PCR方法擴增了DS15株VP2基因,然后將其插入供體質(zhì)粒pFastBacHTA中,構建重組pFastBacHTA-VP2供體質(zhì)粒。再轉化DH10Bac感受態(tài)細胞,經(jīng)藍白斑篩選獲得重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-HTA-VP2。用該重組質(zhì)粒轉染sf9細胞,48h后分別用間接免疫熒光和Western blot試驗檢測靶基因的表達。結果表明我們在sf9細胞中成功表達出VP2蛋白,電鏡負染結果進一步證明,所表達的重組VP2蛋白能夠在昆蟲細胞中自我組裝形成病毒樣顆粒。動物實驗結果表明所制備的病毒樣顆粒具有良好免疫原性。這些研究結果為進一步研制NDPV診斷抗原和病毒樣顆粒疫苗奠定了基礎。
[Abstract]:Since 2014 , there has been a new duck viral infectious disease in many duck farms in eastern China , which is mainly characterized by slow growth and development of ducklings , atrophy of upper and lower beaks , enlargement of the tongue of the duck tongue , and difficulty in walking . The morbidity of the disease is very low , but the incidence rate is 10 % 锝，

本文編號：2036268