本文選題：Col + XV��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：Collagen XV(Col XV)是膠原家族的成員之一,分布在細(xì)胞基底膜表面,在動(dòng)物生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。Col XV與Col XVIII組成MULTIPLEXINs/內(nèi)皮抑素產(chǎn)生的膠原蛋白亞類,它們結(jié)構(gòu)上高度保守,在血管生成、炎癥發(fā)生、腫瘤形成和脂肪代謝等方面具有類似功能。研究發(fā)現(xiàn)Col XVIII促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化,增加內(nèi)臟脂肪的堆積,增加組織重構(gòu),維持能量穩(wěn)態(tài)。Col XV在成脂分化過程中表達(dá)上調(diào),參與組織再生、能量穩(wěn)態(tài)和肥胖相關(guān)疾病的調(diào)節(jié),然而Col XV對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制還有待研究。本研究為了明確Col XV調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制,在脂肪細(xì)胞中超表達(dá)和干擾Col XV,得到以下結(jié)果:1.Col XV促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和抑制脂質(zhì)分解。Col XV在腹股溝白色脂肪、附睪白色脂肪的表達(dá)豐度較高,而在肩胛棕色脂肪、肝臟、肌肉和心臟等組織中的表達(dá)豐度較低,其中白色脂肪組織中Col XV的表達(dá)極顯著高于棕色脂肪中的表達(dá)(P0.01)。在高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)下,Col XV在腹股溝白脂、附睪白脂和棕脂中的表達(dá)均極顯著提高(P0.01)。在脂肪細(xì)胞中,隨著C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表達(dá)上調(diào),Col XV的表達(dá)極顯著上升(P0.01),而CREB的表達(dá)顯著下降(P0.05)。油紅O和Bodipy染色發(fā)現(xiàn),Col XV促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化,加速脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累。超表達(dá)Col XV在0d、4d和8d顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因C/EBPβ、PPARγ和FABP4的表達(dá),干擾Col XV后作用相反(P0.05)。超表達(dá)Col XV促進(jìn)脂合成基因ACCα和FASN的表達(dá),抑制脂分解基因HSL、LPL和ATGL的表達(dá)(P0.05),干擾Col XV后上述基因表達(dá)相反。超表達(dá)Col XV降低細(xì)胞中cAMP和p-PKAThr197的水平,Forskolin逆轉(zhuǎn)這種抑制作用,H89則加強(qiáng)這種抑制作用,干擾Col XV后則激活了cAMP/PKA信號(hào)通路。表明Col XV通過抑制cAMP/PKA信號(hào)通路促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和抑制脂解。2.Col XV通過CREB負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控脂肪細(xì)胞分化和脂代謝。通過構(gòu)建長(zhǎng)度遞減的Col XV啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體和CREB結(jié)合位點(diǎn)(CRE)定點(diǎn)突變的熒光素酶報(bào)告載體,雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)CREB結(jié)合在Col XV啟動(dòng)子上-354 bp~-334 bp處,抑制Col XV的轉(zhuǎn)錄活性。油紅O染色發(fā)現(xiàn)超表達(dá)Col XV促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累,干擾Col XV降低了脂質(zhì)生成,CREB激動(dòng)劑Forskolin處理后使脂滴消融。超表達(dá)Col XV促進(jìn)C/EBPβ、PPARγ和FABP4等的基因表達(dá),干擾Col XV抑制脂分化基因的表達(dá),而Forskolin處理進(jìn)一步降低了它們的表達(dá)。超表達(dá)Col XV促進(jìn)FASN和ACCα的表達(dá),抑制HSL的表達(dá),Forskolin逆轉(zhuǎn)了超表達(dá)Col XV對(duì)脂代謝的作用。干擾Col XV降低FASN和ACCα的表達(dá),提高HSL的表達(dá),Forskolin增強(qiáng)了干擾Col XV后的作用。表明Col XV通過CREB負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)它的啟動(dòng)子活性,進(jìn)而影響脂肪細(xì)胞分化和脂代謝。3.Col XV通過DNA甲基化調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂代謝。采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法發(fā)現(xiàn)在脂肪細(xì)胞分化后Col XV的DNA甲基化水平降低,Col XV的表達(dá)水平升高,甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b)和CpG結(jié)合蛋白3(Mbd3)的mRNA表達(dá)顯著降低。在脂肪細(xì)胞分化第0 d和4 d,Col XV超表達(dá)后抑制了Dnmt1的表達(dá),甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-azacytidine(5-Aza-dC)加劇了這一作用,對(duì)Dnmt3a和Dnmt3b的作用不顯著。5-Aza-dC抑制Col XV的DNA甲基化水平,促進(jìn)它的mRNA表達(dá)。在脂肪細(xì)胞分化第0 d,Col XV超表達(dá)促進(jìn)C/EBPβ、PPARγ的表達(dá),5-Aza-dC顯著降低C/EBPβ、PPARγ的表達(dá);而第4 d在Col XV甲基化被抑制后Col XV上調(diào)的C/EBPβ和PPARγ的表達(dá)被進(jìn)一步增強(qiáng)。在脂肪細(xì)胞分化第0 d和第4 d,超表達(dá)Col XV抑制HSL的mRNA表達(dá),在Col XV甲基化水平降低后加劇了這種抑制作用。油紅O結(jié)果一致,在分化的脂肪細(xì)胞中超表達(dá)Col XV促進(jìn)脂沉積,干擾Col XV抑制脂沉積,Col XV甲基化被抑制后加速了脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴形成。表明Col XV通過DNA甲基化下調(diào)來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和抑制脂肪細(xì)胞的分解代謝。綜上所述,本試驗(yàn)表明Col XV通過抑制cAMP/PKA信號(hào)通路來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和抑制脂質(zhì)分解,并證實(shí)Col XV通過CREB的負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA甲基化抑制來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化和抑制脂肪細(xì)胞分解代謝。
[Abstract]:Collagen XV (Col XV), one of the members of the collagen family, is distributed on the surface of the basal membrane of the cell and plays an important role in the physiological and pathological processes of animals..Col XV and Col XVIII constitute a subclass of collagen produced by MULTIPLEXINs/ endostatin. They are highly conserved in structure, inflammation, tumor formation, and fat metabolism. The study found that Col XVIII promotes adipocyte differentiation, increases the accumulation of visceral fat, increases tissue remodeling, maintains energy homeostasis.Col XV is up-regulated during lipid differentiation, participates in tissue regeneration, energy homeostasis and regulation of obesity related diseases. However, Col XV regulates adipocyte differentiation and its molecular machine In order to determine the mechanism of Col XV regulation of adipocyte differentiation, this study overexpressed and interfered with Col XV in adipocytes. The following results were obtained: 1.Col XV promotes adipocyte differentiation and inhibits lipid decomposition.Col XV in the white fat of the groin, the expression of white fat in epididymis is higher, while in scapula Brown fat, the expression of the epididymal white fat is higher. The expression of Col XV in white fat tissue was significantly higher than that in brown fat (P0.01). The expression of Col XV in white fat in the groin, white fat and brown fat in epididymis was significantly increased (P0.01) under high fat diet (HFD). In adipocytes, with C/EBP beta, PPAR gamma in adipocytes. The expression of Col XV and the expression of FABP4 increased significantly (P0.01), while the expression of CREB decreased significantly (P0.05). Oil red O and Bodipy staining found that Col XV promoted adipocyte differentiation and accelerated the accumulation of lipid droplets in adipocytes. Interference with Col XV is opposite (P0.05). Overexpression of Col XV promotes the expression of ACC alpha and FASN in lipid synthesis genes, inhibits the expression of lipid decomposition genes HSL, LPL and ATGL (P0.05), and the expression of these genes is opposite after interfering Col. The effect of Col XV activates the cAMP/PKA signaling pathway. It indicates that Col XV promotes adipocyte differentiation by inhibiting the cAMP/PKA signaling pathway and inhibits the lipo.2.Col XV to regulate adipocyte differentiation and lipid metabolism through CREB negative transcription. The mutated luciferase reporter carrier, double luciferase activity analysis found that CREB combined with -354 bp~-334 BP at the promoter of Col XV promoter, and inhibited the transcriptional activity of Col XV. Oil red O staining found that the overexpression of Col XV promoted lipid accumulation in fat cells, interfering Col and reducing lipid formation. The expression of Col XV promotes the expression of C/EBP beta, PPAR gamma and FABP4, which interferes with the inhibition of Col XV to inhibit the expression of lipid differentiation genes, while Forskolin treatment further reduces their expression. The expression of alpha, enhanced the expression of HSL, Forskolin enhanced the effect of interference with Col XV. It showed that Col XV regulates its promoter activity through CREB negative transcription, and then affects adipocyte differentiation and lipid metabolism.3.Col XV through DNA methylation to regulate adipocyte differentiation and lipid metabolism. After the differentiation of adipocytes, a hydrogen sulfite sequencing method was used to detect the differentiation of adipocytes after the differentiation of adipocytes. The level of DNA methylation in Col XV decreased, the expression level of Col XV increased, and the mRNA expression of methyltransferase (Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b) and CpG binding protein 3 (Mbd3) decreased significantly. The effect on Dnmt3a and Dnmt3b did not significantly inhibit the DNA methylation level of Col XV and promote its mRNA expression. In the adipocyte differentiation zeroth D, Col XV overexpression promoted the expression of C/EBP beta and PPAR gamma, which significantly reduced the expression of beta and gamma, while fourth Further enhancement. In the adipocyte differentiation zeroth D and fourth D, the overexpression of Col XV inhibits the mRNA expression of HSL, and increases this inhibitory effect after the reduction of Col XV methylation level. The result of the oil red O results is consistent, and the overexpression of Col XV promotes lipid deposition in the differentiated adipocytes, interfering Col to inhibit lipid deposition, and accelerates the inhibition after inhibition methylation is suppressed. The formation of lipid droplets in adipocytes indicates that Col XV can promote adipocyte differentiation and inhibit the catabolism of adipocytes through the downregulation of DNA methylation. To sum up, this experiment shows that Col XV promotes adipocyte differentiation and inhibits lipid decomposition by inhibiting the cAMP/PKA signaling pathway, and that Col XV is regulated by CREB negative transcriptional regulation and DNA methyl. Inhibition can promote adipocyte differentiation and inhibit adipocyte catabolism.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.2

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本文編號(hào)：2032993