本文選題：犬干擾素α + 克隆表達(dá)��； 參考：《華東師范大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展,犬類飼養(yǎng)量日益增多,但是犬病,特別是病毒病的發(fā)病率也在不斷升高,常常導(dǎo)致犬的死亡,給人類造成精神和經(jīng)濟(jì)上的損失。干擾素是一類具有抗病毒活性的細(xì)胞因子,其中干擾素α的抗病毒作用廣譜而強效,犬干擾素a (CaIFNa)在治療多種犬類病毒病中有顯著療效,因此有良好的應(yīng)用前景。但是傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法成本高、制備工藝復(fù)雜,導(dǎo)致CaIFNα價格昂貴。同時目前市場上的CaIFNα活性時間短,需要頻繁注射、治療周期長。因此成本低廉且長效的CaIFNα研發(fā)成為熱點。目前國內(nèi)外關(guān)于基因工程克隆CaIFNα的研究報道較多,但是利用基因工程表達(dá)純化得到活性CaIFNα的完整報道不多,其中主要以大腸桿菌(E.coli)作為表達(dá)系統(tǒng),且大部分CaIFNa以包涵體形式表達(dá)。包涵體需要變性復(fù)性,不僅增加純化過程而且蛋白復(fù)性產(chǎn)率偏低,因此包涵體變復(fù)性技術(shù)至今仍是應(yīng)用E.coli表達(dá)系統(tǒng)制備蛋白質(zhì)的主要瓶頸問題之一,研究者通常希望獲得可溶性的目的蛋白。本文以E.coli作為表達(dá)系統(tǒng),選用不同的標(biāo)簽蛋白與CaIFNα融合表達(dá),分別得到了包涵體形式和可溶性蛋白形式的融合蛋白,并對兩者進(jìn)行比較,為獲得大量有活性的CaIFNα提供途徑。兩親性聚合物做為納米藥物載體,包裹藥物后能延長藥物活性、提高藥物靶向性,被廣泛應(yīng)用和研究,因此是得到長效CaIFNα的可能途徑。聚谷氨酸(PGA)是由生物發(fā)酵的大分子,來源易得、生物可降解,目前有眾多研究證明其是良好的藥物載體。但是PGA具有很強的親水性,單獨在水中難以自組裝,不能直接作為CaIFNα的載體。因此本文將疏水性的苯丙氨酸乙酯鹽酸鹽(PAE)通過酰胺化反應(yīng)連接到PGA的羧基上,將PGA改造成兩親性聚合物材料PGA-PAE。 PGA-PAE同時具有親水區(qū)域和疏水區(qū)域,所以在水中能自組裝形成內(nèi)部疏水和外部親水結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定納米顆粒(NP),在形成過程中能裝載水相中的犬干擾素α,自組裝成為犬干擾素α納米顆粒(NP-CaIFNa).本文對制備得到的NP及NP-CaIFNα進(jìn)行了表征、制備條件優(yōu)化和性質(zhì)研究。本文的研究結(jié)果主要包括以下兩方面：1.CaIFNα的克隆表達(dá)純化及活性測定將CaIFNα的基因序列按照E.coli密碼子進(jìn)行優(yōu)化,隨后構(gòu)建三個表達(dá)載體,使CalFNα與不同標(biāo)簽蛋白(Trx-tag、GST-tag、Nus-tag)融合表達(dá),分別得到融合蛋白Trx-CaIFNα、GST-CaIFNα及Nus-CaIFNα。其中Trx-CaIFNα的表達(dá)量最高,37℃時表達(dá)量占菌體蛋白的71.9%；而Nus-CaIFNα的可溶性最高,當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25℃時100%可溶。對包涵體Trx-CaIFNα進(jìn)行復(fù)性及純化,對可溶性蛋白Nus-CaIFNα進(jìn)行純化。純化后Trx-CaIFNα和Nus-CaIFNα兩個蛋白的純度均大于90%,得率分別為74.8%和6.5%。用犬腎細(xì)胞-皰疹性口炎病毒病(MDCK-VSV)體系測定Trx-CaIFNα和Nus-CalFNα的體外抗病毒活性,結(jié)果測得兩者的活性分別為(2.14±2.79)×1014 U/mol和(1.87±0.92)×1012 U/mol。用腸激酶切除Trx-CaIFNa的標(biāo)簽蛋白,得到CaIFNa,得率為38%,其抗病毒活性為(1.87±0.76)×1015U/mol。本文通過Nus-tag和降低誘導(dǎo)溫度使Nus-CaIFNa全部可溶,不需要變性復(fù)性,節(jié)約了純化過程的時間和成本,該提高可溶性的方法值得借鑒；包涵體Trx-CaIFNa的表達(dá)量最高,高于其他兩種融合蛋白Nus-CaIFNa和GST-CaIFNa,更遠(yuǎn)高于其他研究報道,且復(fù)性得率高達(dá)74.8%；融合蛋白仍然保留了CaIFNa的抗病毒活性。2. NP-CaIFNa的制備和性質(zhì)研究用枯草芽孢桿菌DL發(fā)酵制備PGA,經(jīng)過酒精沉淀和酸降解得到分子量為15-30kD的PGA。用碳化二亞胺作為催化劑,使PAE的氨基與PGA的羧基通過酰胺化反應(yīng)連接,合成PGA-PAE材料。核磁共振結(jié)果表明材料中同時出現(xiàn)PGA和PAE的特征峰,表明材料的正確合成。將PGA-PAE材料與等體積純水混勻,在水中自組裝成納米載體NP,透射電鏡下可見NP為球狀納米顆粒,分散性良好,粒徑分布均勻。當(dāng)PGA-PAE的濃度為40mg/mL、PGA的降解時間為9min、 PGA與PAE的摩爾比(即PAE的投料比)為0.68時,NP粒徑為132nm,PDI為0.114,zeta電勢為40.7mV,濃度為1.77×1013 particles/mL,表明制備得到穩(wěn)定的納米載體NP。以活性較高的Trx-CaIFNα為例,研究NP-CaIFNα。將PGA-PAE材料與等體積Trx-CaIFNα溶液混勻,水相中自組裝成NP-CaIFNα,電鏡下可見NP-CaIFNα為納米尺寸的顆粒狀結(jié)構(gòu),分散性良好。在優(yōu)化制備條件下,NP-CaIFNα粒徑為165nm,PDI為0.157,zeta電勢為42.1mV,濃度為7.29×1012 particles/mL。NP-CaIFNα的體外抗病毒活性為(0.44±3.59)×1014 U/mol,保留了Trx-CaIFNα活性的20%左右。Trx-CaIFNα的體外釋放實驗證明有血清存在時Trx-CaIFNα能緩慢釋放,30d約釋放80%Trx-CaIFNα,提示NP-CaIFNα在體內(nèi)可能緩慢釋放Trx-CaIFNα,延長抗病毒活性。同時NP-CaIFNα在PBS中不會釋放Trx-CaIFNα,提示NP-CaIFNα在體外能保持穩(wěn)定。綜上所述,本文用基因工程技術(shù)純化得到Nus-CaIFNa、Trx-CaIFNα兩種融合蛋白。其中Nus-CaIFNα蛋白全部為可溶性表達(dá),為CaIFNα的可溶性研究提供借鑒；包涵體Trx-CaIFNα的表達(dá)量最高,37℃時表達(dá)量約占菌體蛋白的71.9%；以上結(jié)果為大規(guī)模生產(chǎn)CaIFNα提供了兩條途徑。本文還制備合成了基于PGA的NP-CaIFNα,研究證明NP-CaIFNα具納米尺寸,保留了Trx-CaIFNα體外抗病毒活性,并在有血清條件下緩慢釋放Trx-CaIFNα,提示在體內(nèi)可能具有長效抗病毒活性。本文首次將基于PGA的兩親性納米藥物載體應(yīng)用到CaIFNα上,為長效CaIFNα的開發(fā)提供了新思路。
[Abstract]:In this paper , there are many researches on the expression of CaIFN偽 , which can prolong the activity of CaIFN偽 , which can prolong the activity of CaIFN偽 , and it can not only increase the activity of CaIFN偽 , but also can not be used as a carrier of CaIFN偽 . A stable nanoparticles ( NP ) with inner hydrophobic and outer hydrophilic structures can be formed by self - assembly of PGA - PAE in water . The results of this study include the following two aspects : 1 . Cloning and expression purification of CaIFN偽 and fusion expression of CaIFN偽 in E . coli codon . Three expression vectors are constructed . The expression of Trx - CaIFN偽 , GST - CaIFN偽 and Nus - CaIFN偽 is obtained .
In vitro antiviral activity of Trx - CaIFN偽 and Nus - CalFN - 偽 was determined by the purification of Trx - CaIFN偽 and Nus - CalFN . The results showed that the activity of Trx - CaIFN - 偽 and Nus - CalFN - 偽 was higher than 90 % . The results showed that the activity of Trx - CaIFN - 偽 and Nus - CalFN - 偽 was higher than 90 % . The results showed that the activity of Trx - CaIFN偽 and Nus - CalFN 偽 was ( 1 . 87 鹵 0.76 ) 脳 10 15 U / mol .
The expression of Trx - CaIFNa was the highest , which was higher than that of other two fusion proteins Nus - CaIFNa and GST - CaIFNa , which were much higher than those of other studies , and the yield of Trx - CaIFNa was 74.8 % .
The fusion protein still retains the antiviral activity of CaIFNa . The preparation and properties of NP - CaIFN偽 were studied by using Bacillus subtilis DL fermentation to prepare PGA . The results showed that NP - CaIFN偽 could release Trx - CaIFN偽 in vitro . The results showed that NP - CaIFN偽 could release Trx - CaIFN偽 in vitro . The results showed that NP - CaIFN偽 could release Trx - CaIFN偽 in vitro . The results showed that NP - CaIFN偽 could release Trx - CaIFN偽 in vitro .
The expression of Trx - CaIFN偽 was the highest at 37 鈩，

本文編號：2006955