本文選題：偽狂犬病毒 + miRNA表達(dá)譜�。� 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2015年博士論文

【摘要】：豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以造成新生仔豬神經(jīng)系統(tǒng)疾病和呼吸系統(tǒng)紊亂及懷孕母豬的繁殖障礙為主要癥狀的傳染性疾病。疫苗免疫曾經(jīng)有效地控制了此病的流行和危害,但近年來(lái),許多免疫豬群暴發(fā)偽狂犬病,并造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本實(shí)驗(yàn)室于2012年在江蘇某免疫豬場(chǎng)發(fā)病死亡的仔豬腦組織中分離到一株P(guān)RV JS-2012,經(jīng)全基因組序列分析和感染試驗(yàn)證明該P(yáng)RV發(fā)生了較大變異(Ye et al.,2015),對(duì)各年齡的豬致病力明顯增強(qiáng)(Tong et al.,2015),而且現(xiàn)有的疫苗不能提供完全保護(hù)。本試驗(yàn)試圖通過(guò)分析PRV JS-2012感染PK-15細(xì)胞后引起的細(xì)胞和病毒microRNA(mi RNA)表達(dá)譜變化,為進(jìn)一步研究miRNA轉(zhuǎn)錄后對(duì)PRV復(fù)制、免疫及持續(xù)感染的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。通過(guò)sRNA文庫(kù)構(gòu)建、高通量測(cè)序,我們?cè)赑RV感染和未感染PK-15細(xì)胞的樣品中分別得到109,595,539和112,037,904條高質(zhì)量的小RNAs(sRNA)。利用生物信息學(xué)軟件分析,在PRV JS-2012感染的PK-15細(xì)胞樣品中初步檢測(cè)到了36條mi RNA,其中11條為數(shù)據(jù)庫(kù)中得到驗(yàn)證的高表達(dá)的保守的miRNA,其余25條可能是新的病毒miRNA(vmiRNA);除prv-miR-1、6、16、21和25外,其余20條vmiRNA均通過(guò)stem-loop RT-qPCR方法得到證實(shí)。與α-皰疹病毒miRNA通常編碼在潛伏轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(LLT)區(qū)不同的是,PRV JS-2012編碼的vmiRNA中只有3條(prv-miR-11-5p、prv-miR-12a-3p和prv-miR-17a-5p)分布在LLT區(qū),其余至少17條則像β-皰疹病毒一樣散在分布于PRV整個(gè)基因組,這在α-皰疹病毒中是首次發(fā)現(xiàn)。這些可能的新的mi RNA中,prv-mi R-LLT10a/b-3p、prv-miR-LLT11a/b-5p、prv-miR-12a/b-3p、prv-miR-13a/b-5p、prv-miR-14a/b-5p和prv-miR-17a/b-5p位于內(nèi)部重復(fù)序列(IRS)和末端重復(fù)序列(TRS),而prv-miR-18至25、prv-miR-12 b、prv-miR-13 b、prv-miR-14 b和prv-miR-17由PRV基因組的負(fù)鏈編碼。生物信息學(xué)預(yù)測(cè),這些vmiRNA能調(diào)控包括參與病毒裂解復(fù)制和潛伏感染的相關(guān)基因。雙熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證結(jié)果表明分布在LLT區(qū)的prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT7和prv-miR-LLT9對(duì)PRV轉(zhuǎn)錄極早期基因IE180表達(dá)有抑制作用,prv-mi R-LLT7對(duì)參與病毒復(fù)制調(diào)控的UL48基因(VP16蛋白)表達(dá)有抑制作用,因此這些vmiRNA可能在病毒感染過(guò)程中調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制,而進(jìn)一步功能試驗(yàn)表明體外過(guò)表達(dá)這些vmiRNA的模擬物,進(jìn)而感染PRV后并未明顯抑制IE180和VP16的蛋白表達(dá)水平。病毒感染細(xì)胞后還能通過(guò)影響宿主miRNA表達(dá)譜進(jìn)而有利于病毒的復(fù)制。通過(guò)對(duì)PRV JS-2012感染組和未感染組的sRNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較,分別在感染和未感染的sRNA文庫(kù)中確認(rèn)了303條和295條已知的豬源細(xì)胞miRNA,283條已知的和239條新的宿主miRNA在兩個(gè)sRNA文庫(kù)中是共有。感染的樣品中有8條宿主miRNA顯著上調(diào),5條宿主miRNA顯著下調(diào)。通過(guò)GO富集分析,這些異常表達(dá)的宿主miRNA的靶基因主要參與新陳代謝通路調(diào)控、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)和先天性免疫等過(guò)程。通過(guò)合成這些宿主差異miRNA的模擬物或抑制劑,并將其在PK-15細(xì)胞中過(guò)表達(dá),感染病毒后并沒有發(fā)現(xiàn)這些宿主差異的miRNA對(duì)病毒的復(fù)制有顯著影響。新出現(xiàn)的偽狂犬病毒顯然能突破現(xiàn)有疫苗的免疫防線,使得免疫的豬群發(fā)病。為研究PRV JS-2012抗原性變異情況,本研究制備了JS-2012、SC(經(jīng)典偽狂犬病強(qiáng)毒)和Bartha-K61(基因缺失弱毒疫苗株)的全病毒兔源和鼠源多克隆抗體。交叉中和試驗(yàn)顯示Bartha-K61的全病毒多抗不能很好的中和JS-2012病毒,初步推斷JS-2012變異株的抗原性可能發(fā)生了改變。此外,我們利用Bartha-K61和Bucharest疫苗免疫仔豬。利用制備的疫苗多抗與JS-2012、SC、Bartha-K61和Bucharest病毒進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)。兩種疫苗均在免疫14 d后出現(xiàn)中和抗體,并且兩個(gè)疫苗均是針對(duì)自身疫苗毒株中和效價(jià)最高,針對(duì)JS-2012的中和效價(jià)最低。該結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了JS-2012的抗原性發(fā)生了變化。本研究為進(jìn)一步鑒定PRV流行毒株的抗原變異奠定基礎(chǔ)。綜上所述,本研究首次分析了變異PRV JS-2012感染PK-15細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜情況,分析了JS-2012的vmiRNA的保守性并鑒定了多條新的vmi RNA,并對(duì)其功能做了初步的驗(yàn)證。此外,本文鑒定了變異PRV感染PK-15細(xì)胞后對(duì)的宿主miRNA產(chǎn)生的影響,加深了對(duì)病毒感染細(xì)胞后的miRNA調(diào)控的理解和認(rèn)識(shí)。同時(shí)為研究流行的變異PRV毒株的抗原性差異奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Pseudorabies (PR) is a contagious disease caused by the Pseudorabies virus (PRV), which causes the nervous system diseases and respiratory disorders of newborn piglets and the reproductive disorders of pregnant sows. Vaccine immunity has effectively controlled the epidemic and harm of this disease, but in recent years, many immune pigs have been immunized. In 2012, a strain of PRV JS-2012 was isolated from the brain tissue of a piggery that died in an immune pig farm in Jiangsu. The whole genome sequence analysis and infection test showed that the PRV had a large variation (Ye et al., 2015), and significantly increased the pathogenicity of pigs of all ages (Tong). Et al., 2015), and the existing vaccines do not provide complete protection. This trial attempts to analyze the changes in the expression profiles of microRNA (MI RNA) induced by PRV JS-2012 infected PK-15 cells, laying the foundation for further research on the regulation of PRV replication, immune and persistent infection after miRNA transcription. Sequencing, 109595539 and 112037904 high quality small RNAs (sRNA) were obtained in the samples of PRV infected and uninfected PK-15 cells. Using bioinformatics software, 36 mi RNA were preliminarily detected in the PK-15 cell samples infected with PRV JS-2012, of which 11 were the highly expressed conservative miRN in the database. A, the other 25 may be new virus miRNA (vmiRNA); except for prv-miR-1,6,16,21 and 25, the remaining 20 vmiRNA are confirmed by the stem-loop RT-qPCR method. Only 3 of the PRV JS-2012 encoded vmiRNA are encoded in the latent transcription related factor (LLT) region. R-17a-5p) is distributed in the LLT region, and at least 17 others are distributed in the whole PRV genome like beta herpes virus. This is the first discovery in the alpha herpes virus. In these possible new mi RNA, prv-mi R-LLT10a/b-3p, prv-miR-LLT11a/b-5p, prv-miR-12a/b-3p, prv-miR-13a/b-5p, prv-miR-14a/b-5p, and prv-miR-17a/b-5p are within the internal weight. The complex sequence (IRS) and the end repeat sequence (TRS), and prv-miR-18 to 25, prv-miR-12 B, prv-miR-13 B, prv-miR-14 B and prv-miR-17 are encoded by the negative chain of the PRV genome. Bioinformatics predicts that these vmiRNA can regulate the related genes involved in viral lysis replication and latent infection. The results of the dual luciferase expression system verification show distribution Prv-miR-LLT1, prv-miR-LLT7 and prv-miR-LLT9 have inhibitory effect on the early gene IE180 expression of PRV transcriptional pole in LLT region, prv-mi R-LLT7 has a inhibitory effect on the expression of UL48 gene (VP16 protein) involved in the regulation of viral replication, so these vmiRNA may be replicating the virus in the process of virus infection, and the further functional test indicates in vitro Overexpression of these vmiRNA mimics, and then PRV infection did not significantly inhibit the protein expression level of IE180 and VP16. The virus infected cells can also contribute to the replication of the virus by affecting the host miRNA expression profile. By comparing the sRNA sequencing results of the PRV JS-2012 infection group and the uninfected group, the infection and non infection of the infected and uninfected groups are respectively infected and uninfected. In the sRNA library, 303 and 295 known pig source cells were identified, 283 known and 239 new host miRNA were shared in two sRNA libraries. 8 host miRNA was significantly up-regulated in the infected samples and 5 host miRNA significantly decreased. The target genes for these abnormal expressed host miRNA were mainly involved in the new target genes of the host miRNA. The processes of regulation of metabolic pathways, biological processes, and innate immunity. By synthesizing these miRNA mimics or inhibitors, and overexpressing them in PK-15 cells, after infection, the miRNA has no significant impact on the replication of the virus. The new pseudorabies virus is clearly able to break through In order to study the antigenic variation of PRV JS-2012, the whole virus rabbit source and mouse source polyclonal antibody of JS-2012, SC (classical pseudorabies strong poison) and Bartha-K61 (gene deletion attenuated vaccine strain) were prepared. The cross neutralization test showed that the total virus polyclonal antibody of Bartha-K61 could not be very strong. Good neutralization of the JS-2012 virus, preliminarily infer that the antigenicity of the JS-2012 variant may have changed. In addition, we use Bartha-K61 and Bucharest vaccines to immunization piglets. Using the prepared vaccine, we cross neutralization tests with JS-2012, SC, Bartha-K61 and Bucharest viruses. The two vaccines are neutralized after 14 d. The neutralization titers of the two vaccines were the highest and the neutralization titer against JS-2012 was the lowest. The results further indicated that the antigenicity of JS-2012 was changed. This study was the basis for further identification of the antigen variation of the PRV epidemic strains. To sum up, this study was the first to analyze the variant PRV JS-2012 infection of PK-15 cells. After miRNA expression profiles, the conservatism of JS-2012 vmiRNA was analyzed and a number of new VMI RNA were identified, and their function was preliminarily verified. In addition, the effects of PRV infected PK-15 cells on the host miRNA production were identified, and the understanding and understanding of miRNA regulation after the virus infected cells were deepened. The variation of the antigenicity of the variant PRV strain laid the foundation.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2003737