本文選題：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 + 豬圓環(huán)病毒2型��； 參考：《南京農業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的兩種重要病原。本研究利用感染性克隆技術成功構建了能夠表達PCV2 ORF2基因的重組PRRSV rTJM/Cap毒株,豬體免疫保護試驗證明,rTJM/Cap活疫苗能提供對PCV2的免疫保護。同時,建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體間接ELISA檢測方法,為該病新型疫苗和ELISA試劑盒研制奠定了基礎。具體內容如下:1.表達PCV2 ORF2基因的重組PRRSV的構建與鑒定本研究采用PCR方法構建PRRSV疫苗株TJM-F92全長cDNA克隆載體pCMV-TJM,并在其ORF7和3'UTR之間插入Afl Ⅱ/Mlu Ⅰ酶切位點和轉錄調控序列TRS6,構建獲得pCMV-TJM-TRS表達載體。將PCV2 ORF2基因插入該載體Afl Ⅱ/MuⅠ 位點,獲得重組質粒 pCMV-TJM-Cap。將 pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分別轉染Marc-145細胞,拯救獲得3種重組病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap。基因測序列、酶切鑒定、Western blot、間接免疫熒光和病毒生長特性結果顯示,3種重組PRRSV病毒都含有特征性分子標記,在Marc-145細胞增殖特性與親本病毒相似;rTJM/Cap傳至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染細胞能有效表達PCV2 Cap蛋白,從而為PRRSV致病機制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基礎。2.表達PCV2 ORF2基因的重組PRRSV對PCV2的免疫保護效力研究本研究選取28-30日齡健康仔豬,采用重組病毒rTJM/Cap毒株活疫苗(106.0TCID50/mL)和rTJM/Cap毒株BEI滅活疫苗,進行免疫保護試驗,結果為:仔豬免疫rTJM/Cap活疫苗后能夠刺激機體產生高水平的PCV2特異性ELISA抗體和中和抗體,但PCV2細胞免疫反應不明顯;攻毒后,rTJM/Cap活疫苗組相對日增重高于攻毒對照組,rTJM/Cap活疫苗能顯著降低PCV2病毒血癥和淋巴結病毒載量,rTJM/Cap活疫苗組豬臨床癥狀及肺和淋巴結組織病理變化明顯明顯低于攻毒對照組。rTJM/Cap滅活疫苗免疫組攻毒后PCV2病毒血癥、淋巴結組織病變和抗原測定結果與攻毒對照組相似。證明重組病毒rTJM/Cap活疫苗免疫后可以為豬體提供一定的抵御PCV2的保護力,為PCVD新型疫苗研究奠定了基礎。3.PRRSV抗體間接ELISA檢測方法的建立本研究用差速離心純化的PRRSV全病毒作為包被抗原,建立了PRRSV間接ELISA抗體檢測方法。最佳反應條件是:抗原包被濃度2μg/mL,包被條件為4℃ 12h,用含1%BSA的PBST封閉37℃ 2h,血清反應條件為37℃ 1h,HRP-SPA 1:20000,37℃作用45min,TMB最佳反應條件為37℃避光作用20min。選定標準陰、陽性對照采用S/P比值作為判定標準,S/P0.369,判為陽性,S/P0.276,則判為陰性;S/P介于兩者之間判為可疑。該方法與FMDV、CSFV、PRV、PEDV、PCV2陽性血清無交叉反應;批內和批間重復性試驗變異系數均低于10%。與IDEXX公司的PRRSV抗體檢測試劑盒比較,其敏感性、特異性及符合率分別為100.0%、88.2%和92.7%。證明本方法具有特異性強、重復性好、靈敏度高和符合率高等優(yōu)點,為PRRSV間接ELISA抗體檢測試劑盒研制奠定了基礎。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSVV) and Porcine circovirus type 2 (Porcinecircovirustype2 PCV2) are two major pathogens that harm the world pig industry. In this study, a recombinant PRRSV rTJM/Cap strain expressing PCV2 ORF2 gene was successfully constructed by using infectious cloning technique. The porcine body immunity protection test showed that rTJM / Cap live vaccine could provide immunity protection to PCV2. At the same time, the indirect ELISA detection method of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antibody was established, which laid a foundation for the development of new vaccine and ELISA kit. The details are as follows: 1. Construction and Identification of Recombinant PRRSV expressing PCV2 ORF2 Gene; in this study, the full-length cDNA clone vector pCMV-TJM of PRRSV vaccine strain TJM-F92 was constructed by PCR method, and Afl 鈪，

本文編號：1961953