本文選題：豬繁殖與呼吸綜合征病毒 + 豬圓環(huán)病毒2型��； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的兩種重要病原。本研究利用感染性克隆技術(shù)成功構(gòu)建了能夠表達(dá)PCV2 ORF2基因的重組PRRSV rTJM/Cap毒株,豬體免疫保護(hù)試驗(yàn)證明,rTJM/Cap活疫苗能提供對(duì)PCV2的免疫保護(hù)。同時(shí),建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法,為該病新型疫苗和ELISA試劑盒研制奠定了基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:1.表達(dá)PCV2 ORF2基因的重組PRRSV的構(gòu)建與鑒定本研究采用PCR方法構(gòu)建PRRSV疫苗株TJM-F92全長(zhǎng)cDNA克隆載體pCMV-TJM,并在其ORF7和3'UTR之間插入Afl Ⅱ/Mlu Ⅰ酶切位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6,構(gòu)建獲得pCMV-TJM-TRS表達(dá)載體。將PCV2 ORF2基因插入該載體Afl Ⅱ/MuⅠ 位點(diǎn),獲得重組質(zhì)粒 pCMV-TJM-Cap。將 pCMV-TJM、pCMV-TJM-TRS和pCMV-TJM-Cap分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞,拯救獲得3種重組病毒rTJM、rTJM/TRS和rTJM/Cap�；驕y(cè)序列、酶切鑒定、Western blot、間接免疫熒光和病毒生長(zhǎng)特性結(jié)果顯示,3種重組PRRSV病毒都含有特征性分子標(biāo)記,在Marc-145細(xì)胞增殖特性與親本病毒相似;rTJM/Cap傳至第8代,仍含有外源Cap基因,病毒感染細(xì)胞能有效表達(dá)PCV2 Cap蛋白,從而為PRRSV致病機(jī)制和PRRSV-PCV2疫苗研究奠定了重要基礎(chǔ)。2.表達(dá)PCV2 ORF2基因的重組PRRSV對(duì)PCV2的免疫保護(hù)效力研究本研究選取28-30日齡健康仔豬,采用重組病毒rTJM/Cap毒株活疫苗(106.0TCID50/mL)和rTJM/Cap毒株BEI滅活疫苗,進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果為:仔豬免疫rTJM/Cap活疫苗后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的PCV2特異性ELISA抗體和中和抗體,但PCV2細(xì)胞免疫反應(yīng)不明顯;攻毒后,rTJM/Cap活疫苗組相對(duì)日增重高于攻毒對(duì)照組,rTJM/Cap活疫苗能顯著降低PCV2病毒血癥和淋巴結(jié)病毒載量,rTJM/Cap活疫苗組豬臨床癥狀及肺和淋巴結(jié)組織病理變化明顯明顯低于攻毒對(duì)照組。rTJM/Cap滅活疫苗免疫組攻毒后PCV2病毒血癥、淋巴結(jié)組織病變和抗原測(cè)定結(jié)果與攻毒對(duì)照組相似。證明重組病毒rTJM/Cap活疫苗免疫后可以為豬體提供一定的抵御PCV2的保護(hù)力,為PCVD新型疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。3.PRRSV抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立本研究用差速離心純化的PRRSV全病毒作為包被抗原,建立了PRRSV間接ELISA抗體檢測(cè)方法。最佳反應(yīng)條件是:抗原包被濃度2μg/mL,包被條件為4℃ 12h,用含1%BSA的PBST封閉37℃ 2h,血清反應(yīng)條件為37℃ 1h,HRP-SPA 1:20000,37℃作用45min,TMB最佳反應(yīng)條件為37℃避光作用20min。選定標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性對(duì)照采用S/P比值作為判定標(biāo)準(zhǔn),S/P0.369,判為陽(yáng)性,S/P0.276,則判為陰性;S/P介于兩者之間判為可疑。該方法與FMDV、CSFV、PRV、PEDV、PCV2陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng);批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均低于10%。與IDEXX公司的PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒比較,其敏感性、特異性及符合率分別為100.0%、88.2%和92.7%。證明本方法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高和符合率高等優(yōu)點(diǎn),為PRRSV間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒研制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSVV) and Porcine circovirus type 2 (Porcinecircovirustype2 PCV2) are two major pathogens that harm the world pig industry. In this study, a recombinant PRRSV rTJM/Cap strain expressing PCV2 ORF2 gene was successfully constructed by using infectious cloning technique. The porcine body immunity protection test showed that rTJM / Cap live vaccine could provide immunity protection to PCV2. At the same time, the indirect ELISA detection method of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antibody was established, which laid a foundation for the development of new vaccine and ELISA kit. The details are as follows: 1. Construction and Identification of Recombinant PRRSV expressing PCV2 ORF2 Gene; in this study, the full-length cDNA clone vector pCMV-TJM of PRRSV vaccine strain TJM-F92 was constructed by PCR method, and Afl 鈪，

本文編號(hào)：1961953