本文選題：馬立克氏病病毒 + 重組病毒�。� 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：馬立克氏病(Marek’s disease,MD)是雞的一種高度接觸性腫瘤病,以淋巴組織的增生和腫瘤的形成為特征。馬立克氏病病毒(MDV)包括三個(gè)血清型。所有能引起腫瘤的MDV病毒屬于血清1型(MDV-1),天然不致瘤的MDV屬于血清2型,火雞皰疹病毒(HVT)屬于血清3型。2001年,從中國廣西某雞場中分離得到一株1型MDV GX0101,其特點(diǎn)是:有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)長末端重復(fù)序列(LTR)的插入。為了解REV長末端重復(fù)序列(LTR)的插入給GX0101帶來的影響,在將該毒株構(gòu)建成細(xì)菌人工染色體(BAC)克隆的基礎(chǔ)上,將REV-LTR敲除構(gòu)建成了重組病毒GX0101ΔLTR,通過動(dòng)物證明,REV-LTR的插入導(dǎo)致了GX0101的水平傳播能力的顯著增強(qiáng);在BAC—GX0101的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步敲除兩個(gè)致腫瘤基因Meq,得到的缺失株GX0101Δmeq,后期研究發(fā)現(xiàn),該缺失株在失去對雞群的致病性和免疫抑制的同時(shí),還能對雞群起到很好的保護(hù)作用,其保護(hù)效果要超出現(xiàn)有CVI988疫苗。本研究以GX0101ΔMeq作為載體表達(dá)H5N2禽流感病毒的HA基因,成功構(gòu)建了一株重組病毒。1.抗H5N2-HA鼠多克隆抗體的制備及H5N2-HA真核表達(dá)載體的構(gòu)建為了驗(yàn)證以GX0101ΔMeq為載體構(gòu)建的表達(dá)H5N2-HA的重組病毒中的HA基因在體外能否正常表達(dá),首先需要制備抗H5N2禽流感HA的鼠多克隆抗體。HA基因,先從NCBI上獲取H5N2禽流感JX534549株的HA基因全序列,再由生工生物工程(上海)有限公司合成。將其分成兩段分別插入到PET-32a原核表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了能夠分段表達(dá)HA蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒,將兩個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21菌株。通過誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)現(xiàn),只有一段HA蛋白能夠大量表達(dá),而另一段沒有表達(dá),我們用大量表達(dá)的該段的HA蛋白作為抗原免疫小鼠,三免后采集鼠的血清,為了檢測該血清能否作為針對HA蛋白的多克隆抗體,我們以此血清作為一抗,通過IFA檢測,經(jīng)禽流感JX534549株的HA基因的感染性克隆轉(zhuǎn)染的CEF細(xì)胞中的HA蛋白,IFA結(jié)果顯示100倍稀釋的該鼠的血清能夠檢測到細(xì)胞中HA蛋白的存在。結(jié)果可證明:在本研究中,鼠的血清可以作為多克隆抗體檢測HA蛋白的存在,并可在后續(xù)研究中用于檢測重組MDV中HA基因的表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)H5N2-HA的重組病毒,首先我們需要構(gòu)建能夠在真核系統(tǒng)中表達(dá)HA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。將HA—ORF完整的克隆進(jìn)真核表達(dá)載體pc DNA3.1(-)中,并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞。以制備的HA多克隆抗體作為一抗,通過IFA驗(yàn)證,真核表達(dá)質(zhì)粒中的HA基因能夠成功表達(dá)。這些證明,本研究中構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒能夠成功表達(dá)HA基因,可以用于進(jìn)一步的研究。2.以GX0101ΔMeq為載體,應(yīng)用RedE/T重組系統(tǒng)和Flp/FRT重組系統(tǒng)構(gòu)建一株表達(dá)H5N2-HA基因的重組病毒r GX-CMV-HA第一步:在HA基因表達(dá)盒前引入Kanr抗性篩選基因,以后電轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌EL250中,在重組系統(tǒng)Red E/T的作用下,這段帶有Kanr抗性篩選基因的HA表達(dá)盒就作為外源插入片段整合到載體GX0101ΔMeq上;第二步:在L-阿拉伯糖的誘導(dǎo)下,利用重組系統(tǒng)Flp/FRT將Kanr從重組質(zhì)粒中敲除掉。通過驗(yàn)證,從含有完全敲除了Kanr抗性篩選基因的重組質(zhì)粒pr GX-CMV-HA的EL250大腸桿菌中提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,通過IFA驗(yàn)證重組病毒中HA基因的表達(dá)。結(jié)果表明,通過以上兩步重組方法,成功獲得了重組病毒r GX-CMV-HA,并且IFA驗(yàn)證表明HA基因能在重組病毒中成功表達(dá)。
[Abstract]:A recombinant virus type 1 ( MDV - 1 ) was isolated from a chicken farm in Guangxi . The recombinant plasmid pr GX - CMV - HA was cloned into E . coli EL250 . The recombinant plasmid pr GX - CMV - HA was transfected into E . coli EL250 . The results showed that the recombinant virus r GX - CMV - HA was successfully obtained from the recombinant plasmid pr GX - CMV - HA containing the Kanr resistance screening gene . The results showed that the recombinant virus r GX - CMV - HA was successfully obtained by the two - step recombination method .
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1936098