本文選題：肌肉生長抑制素 + RNA干擾��； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學》2015年博士論文

【摘要】：肌肉生長抑制素(Myostatin,MSTN),是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族中的一員,又稱為生長分化因子-8(GDF-8)。MSTN基因敲除的超級鼠和雙肌牛的研究證明該基因是骨骼肌生長發(fā)育的負調(diào)控因子。RNA干擾(RNAi)是近些年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于自然界中的由dsRNA介導的一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)現(xiàn)象。目前該技術(shù)已經(jīng)成為一種新的研究特定基因功能及其表達調(diào)控的工具。基因打靶(Gene targeting)是一種對生物遺傳信息進行定向改造的技術(shù)手段,傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)是指利用外源DNA與細胞基因組DNA同源序列發(fā)生同源重組,將胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESC)或胎兒成纖維細胞作為介導,以研究靶基因功能及其在相關(guān)疾病發(fā)生機制中的作用為目的,從而人為地對細胞基因組進行位點特異性修飾的實驗技術(shù)。本研究選取山羊MSTN基因作為研究對象,分別采用RNAi和基因打靶技術(shù)進行阻斷MSTN基因表達的研究。首先,針對MSTN cDNA序列設(shè)計并構(gòu)建了4個表達microRNA(miRNA)的干擾載體以及1個過表達MSTN的載體,然后將這4個干擾載體與過表達載體分別共轉(zhuǎn)染293FT細胞以驗證miRNA的有效性,并篩選出2個干擾效率最高的miRNA。再將這兩個miRNA連接到含有GFP標記的表達載體上,將該載體分別轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(GFF)和骨骼肌衛(wèi)星細胞(SMSC)以進一步驗證miRNA的干擾效果,同時還檢測了干擾素反應誘發(fā)基因IFN-β、OAS2、Mx1、IFI44和STAT1的表達情況。此外,利用基因打靶技術(shù)構(gòu)建了山羊MSTN基因敲除載體并將該載體轉(zhuǎn)染GFF細胞,用藥物篩選抗性細胞克隆,經(jīng)鑒定后獲得打靶陽性的細胞克隆,以用于轉(zhuǎn)基因下游體細胞核移植過程。本研究共分為五個部分,主要的研究結(jié)果如下:第一部分山羊MSTN基因miRNA干擾載體的構(gòu)建及其有效性檢測。首先,利用在線工具Block-iT RNAi Designer設(shè)計了4個針對山羊MSTN mRNA序列的miRNA序列,將其轉(zhuǎn)換成編碼pre-miRNA的DNA序列,化學合成兩條寡聚單鏈DNA并退火處理,然后連接到載體pcDNA6.2-GW/miR上,得到miRNA干擾載體pD-miRNA。采用基因合成方法合成MSTN CDS序列并與載體pEGFP-C1連接,得到MSTN過表達載體C1-MSTN,其中GFP和MSTN構(gòu)成融合基因。將pD-miRNA和C1-MSTN以3:1的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293FT細胞,轉(zhuǎn)染24h后,保證所有拍攝條件一致并用熒光顯微鏡拍照,然后分析細胞照片的熒光強度,熒光強度的平均值代表了靶基因的蛋白表達水平。轉(zhuǎn)染48h后,收集轉(zhuǎn)染的細胞并將其平均分為兩部分,其中一半細胞用于qPCR分析,另一半細胞用于western blot分析。通過熒光強度分析、qPCR和western blot三種方法檢測MSTN基因的表達量,結(jié)果表明,4個miRNA均能顯著抑制MSTN表達,其中miRNA-1和miRNA-3的干擾效率最高,對MSTN mRNA和蛋白質(zhì)的干擾效率分別為38%和48%。這些結(jié)果說明設(shè)計的miRNA能夠特異性沉默山羊MSTN基因,篩選出的miRNA-1和miRNA-3可以用于后續(xù)試驗沉默內(nèi)源性MSTN的研究。第二部分GFF細胞內(nèi)MSTN基因沉默的研究及脫靶效應的檢測。采集胎齡60d的山羊胎兒,利用組織塊培養(yǎng)法結(jié)合胰蛋白酶消化法分離純化得到GFF細胞,細胞性別鑒定為雌性,繪制的生長曲線顯示細胞增殖特性正常,轉(zhuǎn)染效率為80%,符合轉(zhuǎn)基因克隆的基本要求。細胞抗性試驗確定殺稻瘟菌素篩選細胞的最佳濃度為10～12μg/mL。將miRNA-1和miRNA-3克隆到載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR上,得到熒光型干擾載體pDG-miRNA,其中GFP作為報告基因能夠監(jiān)控miRNA表達。將pDG-miRNA載體瞬時轉(zhuǎn)染GFF細胞,發(fā)現(xiàn)miRNA-1和miRNA-3均能有效抑制MSTN基因的表達,但同時檢測到IFN反應誘發(fā)基因IFN-β和OAS2的表達量急劇上升。將pDG-miRNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFF細胞,發(fā)現(xiàn)僅miRNA-1能有效抑制MSTN基因的表達,而IFN-β和OAS2的表達量與瞬時轉(zhuǎn)染相比明顯下降。這些結(jié)果說明免疫刺激引發(fā)的脫靶效應隨著導入miRNA的濃度減少而降低,降低miRNA的濃度有利于減少RNAi引起的脫靶效應。第三部分SMSC細胞內(nèi)MSTN基因沉默的研究及脫靶效應的檢測。取山羊胎兒股外側(cè)肌,采用膠原酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法分離純化SMSC細胞。由于SMSC細胞在體外培養(yǎng)時容易分化和融合形成肌管結(jié)構(gòu),所以該細胞原代培養(yǎng)48h后及時地做細胞傳代并嚴格控制細胞密度。通過Desmin蛋白的免疫熒光染色和融合形成肌管的方法,鑒定SMSC細胞具有較高的純度以及成肌特性。SMSC細胞的轉(zhuǎn)染效率為70%,符合基因沉默試驗的基本要求。將pDG-miRNA載體瞬時轉(zhuǎn)染SMSC細胞,發(fā)現(xiàn)miRNA-1和miRNA-3均能有效抑制MSTN基因的表達,但也檢測到IFN反應誘發(fā)基因Mx1、IFI44和STAT1的表達量均顯著上升。這些結(jié)果說明miRNA-1和miRNA-3在SMSC細胞內(nèi)觸發(fā)了免疫應激反應,從而導致脫靶效應的產(chǎn)生。第四部分山羊MSTN基因打靶載體的構(gòu)建及其正負篩選標記的有效性檢測。利用長片段PCR擴增技術(shù)從山羊基因組中獲得了基因打靶所需的兩個同源臂,其中5'同源臂長度為5.2kb,位于5'調(diào)控區(qū)和內(nèi)含子2之間;3'同源臂長度為1.1kb,位于外顯子3和3'調(diào)控區(qū)。將兩片段分別克隆到pMD19-T載體上,進行測序鑒定,與山羊、牛MSTN基因同源性分別為99.7%、95%,說明擴增片段確實是山羊MSTN基因,完全可以用于基因打靶載體構(gòu)建。將兩個同源臂分別將其克隆到載體ploxPneo上,得到含有正負篩選標記基因Neo和Tk的打靶載體ploxPneo-MSTN,進行PCR、酶切鑒定及相應DNA序列測定,證實MSTN基因打靶載體構(gòu)建成功。將打靶載體用NotⅠ酶線性化后轉(zhuǎn)染GFF細胞,分別利用G418(600μg/mL),G418(600μg/mL)/GCV(2μM)進行抗性細胞克隆篩選,對細胞克隆數(shù)目進行統(tǒng)計分析,證實了Neo和Tk基因的有效性.第五部分山羊GFF細胞的基因打靶與中靶細胞克隆的檢測。進行細胞G418毒性試驗,藥物篩選濃度以7d內(nèi)細胞全部死亡為標準,確定了G418篩選細胞的最佳濃度為700μg/mL。將線性化的ploxPneo-MSTN通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染整合到GFF細胞基因組的MSTN基因座上,利用G418和GCV對細胞克隆進行藥物篩選和單克隆分離,經(jīng)擴大培養(yǎng)后,獲得狀態(tài)良好的抗性細胞克隆247個。對抗性細胞克隆進行PCR和測序鑒定,最終得到1個打靶陽性細胞克隆,經(jīng)計算,基因打靶的絕對效率是7.1×10~(-9),基因打靶的相對效率是4.1×10~(-3)。
[Abstract]:In this study , we selected goat MSTN gene as the research object to investigate the effect of target gene function and its expression and regulation . The expression of MSTN gene was detected by means of fluorescence intensity analysis , qPCR and western blot . The results showed that both miRNA - 1 and miRNA - 3 could effectively inhibit the expression of MSTN gene . The results showed that miRNA - 1 and miRNA - 3 could effectively inhibit the expression of MSTN gene . Using G418 ( 600 渭g / mL ) , G418 ( 600 渭g / mL ) / G26 ( 2 渭M ) , the selection of cell clones was performed . The results showed that the optimal concentration was 700 渭g / mL .
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;S827

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 雷宇華;廖崢嶸;趙娟;王忠海;;認識小干擾RNA、微RNA和RNA干擾[J];生物學教學;2009年08期

2 馬晉平,詹文華,汪建平,高勁松,殷勤偉;RNA·RNA干擾[J];自然雜志;2003年01期

3 劉惠莉,陸承平,朱偉云;雞傳染性支氣管炎病毒的RNA干擾[J];中國病毒學;2005年03期

4 邱齡;肖傳實;曾秋棠;李茂蓮;;靶向血管緊張素Ⅱ受體基因的短發(fā)夾RNA的功能比較[J];第四軍醫(yī)大學學報;2006年23期

5 孫宇;馬玉媛;羅佳;章金剛;;應用RNA干擾沉默豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒[J];生物技術(shù)通訊;2012年01期

6 于國龍,何蘊韶;遺傳學研究的新工具:RNA干擾[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2005年04期

7 王秀杰;;RNA干擾:雙鏈RNA引起的基因沉默機制——2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎成果簡介[J];科技導報;2006年12期

8 徐寧,陳智;哺乳動物RNA干擾中小干擾RNA載體表達策略及其表達盒[J];國外醫(yī)學.流行病學傳染病學分冊;2004年06期

9 李鐵軍;康楷;宋建寧;胡瓚斕;張秉強;張才全;;RNA干擾抑制結(jié)腸癌細胞血管內(nèi)皮生長因子表達[J];中國生物工程雜志;2007年08期

10 李婷婷,趙麗娜,寧寒冰,韓英,劉志國,樊代明;雙向啟動子小干擾RNA載體干擾效率的驗證[J];細胞與分子免疫學雜志;2005年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 郭德銀;;RNA干擾在病毒研究和控制中的應用[A];第二屆中國青年學者微生物遺傳學學術(shù)研討會論文集[C];2006年

2 丁浩;李菊香;孫國芳;洪葵;程曉曙;;RNA干擾沉默細胞信號轉(zhuǎn)導抑制因子-1的表達對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響[A];第十三次全國心血管病學術(shù)會議論文集[C];2011年

3 牛鵬霞;沈鶴;趙書紅;樊斌;;一種RNA干擾載體的構(gòu)建及驗證[A];第十二次全國畜禽遺傳標記研討會論文集[C];2010年

4 張玉稚;王漢森;潘虹;李美蓉;包新華;金靖;吳希如;;大鼠Mecp_2基因的RNA干擾有效序列篩選[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

5 孔祥平;;RNA干擾與乙型肝炎[A];2004年慢性乙型肝炎免疫治療進展學習班論文集[C];2004年

6 姜林娣;王吉耀;王漢洲;趙鳳娣;鮑春德;鄒和建;;RNA干擾抑制COX-2合成以及對類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞生物學活性的影響研究[A];第十二屆全國風濕病學學術(shù)會議論文集[C];2007年

7 譚兵;李瑜元;聶玉強;杜艷蕾;;RNA干擾對活化的小鼠巨噬細胞TNFα表達的影響[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

8 朱t 燕;仇灝;周迎會;吳士良;;一種新型糖基轉(zhuǎn)移酶：β3GalT7基因的RNA干擾表達載體構(gòu)建及其細胞學表型功能的初步研究[A];2008年全國糖生物學學術(shù)會議論文摘要[C];2008年

9 詹鷹;劉繼紅;封江南;肖恒軍;李忠遠;張朝暉;王濤;陳俊;王少剛;葉章群;;腺病毒介導的RNA干擾對人陰莖海綿體平滑肌細胞PDE5基因表達的抑制作用[A];第十六屆全國泌尿外科學術(shù)會議論文集[C];2009年

10 陳敏;何丹;馮九庚;唐容;洪濤;蔣麗萍;;RNA干擾沉默Cx43基因表達抑制血管再狹窄[A];中國藥理學會第十一次全國學術(shù)會議專刊[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 張中橋;第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院實現(xiàn)腫瘤特異性RNA干擾[N];中國醫(yī)藥報;2006年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 何國棟;RNAi抑制HIF-1α表達對腫瘤糖代謝影響的實驗研究[D];復旦大學;2012年

2 王海濤;RNA干擾沉默縫隙連接蛋白43對泌乳素腺瘤中垂體瘤轉(zhuǎn)化基因表達的影響[D];青島大學;2016年

3 鐘部帥;RNA干擾和基因打靶技術(shù)阻斷山羊體細胞MSTN基因表達的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2015年

4 趙平;RNA干擾抑制結(jié)締組織生長因子對瘢痕疙瘩成纖維細胞功能影響的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2008年

5 黃捷;RNA干擾熱休克蛋白27基因?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移的影響[D];福建醫(yī)科大學;2009年

6 陳家文;RNA三級結(jié)構(gòu)折疊以及RNA干擾相關(guān)的動力學[D];武漢大學;2013年

7 陳波斌;核酶和RNA干擾靶向治療慢性粒細胞性白血病的實驗研究[D];復旦大學;2003年

8 蔡從利;以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的RNA干擾方法的建立以及凋亡相關(guān)基因HSD11的功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2005年

9 梁之聘;多靶位RNA干擾對HIV-1抑制作用的研究[D];南開大學;2014年

10 魏軍民;RNA干擾逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的實驗研究[D];山東大學;2005年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 曹布道;dsRNA和重組TMV介導的針對玉米黏蟲Chitinase基因的RNA干擾研究[D];內(nèi)蒙古大學;2015年

2 馮尚祥;人胰島素樣生長因子-1和RNA干擾多聚蛋白聚糖酶-1基因?qū)θ斯撬韪杉毎羌艿挠绊懷芯縖D];青島大學;2015年

3 王超;Tf-PEG-PEI載RNA干擾質(zhì)粒靶向沉默PC-3細胞核干因子的體外實驗研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

4 王雷;甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）RNA干擾載體的構(gòu)建及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2015年

5 邢艷茹;褐飛虱Dnmt1和N6amt2的表達和功能分析及甜菜夜蛾RNA干擾致死基因的克隆[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2014年

6 劉青青;RNA干擾調(diào)控水稻齒矮病毒在介體褐飛虱培養(yǎng)細胞內(nèi)的持久侵染[D];福建農(nóng)林大學;2015年

7 邵丹丹;家蠶BmVps4和BmVta1功能的初步研究[D];江蘇大學;2016年

8 范冰玉;轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥吸收轉(zhuǎn)運鉀離子的研究及RNA干擾載體的構(gòu)建[D];吉林大學;2016年

9 楊帥;馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）RNA干擾核心元件基因的克隆與驗證[D];石河子大學;2016年

10 陳蕾;煙草NtMAX3和NtMAX4基因克隆及RNA干擾研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

，

本文編號：1911608