本文選題：肌肉生長(zhǎng)抑制素 + RNA干擾　； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin,MSTN),是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族中的一員,又稱為生長(zhǎng)分化因子-8(GDF-8)。MSTN基因敲除的超級(jí)鼠和雙肌牛的研究證明該基因是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。RNA干擾(RNAi)是近些年發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于自然界中的由dsRNA介導(dǎo)的一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)現(xiàn)象。目前該技術(shù)已經(jīng)成為一種新的研究特定基因功能及其表達(dá)調(diào)控的工具�；虼虬�(Gene targeting)是一種對(duì)生物遺傳信息進(jìn)行定向改造的技術(shù)手段,傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)是指利用外源DNA與細(xì)胞基因組DNA同源序列發(fā)生同源重組,將胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESC)或胎兒成纖維細(xì)胞作為介導(dǎo),以研究靶基因功能及其在相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制中的作用為目的,從而人為地對(duì)細(xì)胞基因組進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本研究選取山羊MSTN基因作為研究對(duì)象,分別采用RNAi和基因打靶技術(shù)進(jìn)行阻斷MSTN基因表達(dá)的研究。首先,針對(duì)MSTN cDNA序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建了4個(gè)表達(dá)microRNA(miRNA)的干擾載體以及1個(gè)過表達(dá)MSTN的載體,然后將這4個(gè)干擾載體與過表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞以驗(yàn)證miRNA的有效性,并篩選出2個(gè)干擾效率最高的miRNA。再將這兩個(gè)miRNA連接到含有GFP標(biāo)記的表達(dá)載體上,將該載體分別轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFF)和骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SMSC)以進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA的干擾效果,同時(shí)還檢測(cè)了干擾素反應(yīng)誘發(fā)基因IFN-β、OAS2、Mx1、IFI44和STAT1的表達(dá)情況。此外,利用基因打靶技術(shù)構(gòu)建了山羊MSTN基因敲除載體并將該載體轉(zhuǎn)染GFF細(xì)胞,用藥物篩選抗性細(xì)胞克隆,經(jīng)鑒定后獲得打靶陽性的細(xì)胞克隆,以用于轉(zhuǎn)基因下游體細(xì)胞核移植過程。本研究共分為五個(gè)部分,主要的研究結(jié)果如下:第一部分山羊MSTN基因miRNA干擾載體的構(gòu)建及其有效性檢測(cè)。首先,利用在線工具Block-iT RNAi Designer設(shè)計(jì)了4個(gè)針對(duì)山羊MSTN mRNA序列的miRNA序列,將其轉(zhuǎn)換成編碼pre-miRNA的DNA序列,化學(xué)合成兩條寡聚單鏈DNA并退火處理,然后連接到載體pcDNA6.2-GW/miR上,得到miRNA干擾載體pD-miRNA。采用基因合成方法合成MSTN CDS序列并與載體pEGFP-C1連接,得到MSTN過表達(dá)載體C1-MSTN,其中GFP和MSTN構(gòu)成融合基因。將pD-miRNA和C1-MSTN以3:1的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后,保證所有拍攝條件一致并用熒光顯微鏡拍照,然后分析細(xì)胞照片的熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度的平均值代表了靶基因的蛋白表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48h后,收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并將其平均分為兩部分,其中一半細(xì)胞用于qPCR分析,另一半細(xì)胞用于western blot分析。通過熒光強(qiáng)度分析、qPCR和western blot三種方法檢測(cè)MSTN基因的表達(dá)量,結(jié)果表明,4個(gè)miRNA均能顯著抑制MSTN表達(dá),其中miRNA-1和miRNA-3的干擾效率最高,對(duì)MSTN mRNA和蛋白質(zhì)的干擾效率分別為38%和48%。這些結(jié)果說明設(shè)計(jì)的miRNA能夠特異性沉默山羊MSTN基因,篩選出的miRNA-1和miRNA-3可以用于后續(xù)試驗(yàn)沉默內(nèi)源性MSTN的研究。第二部分GFF細(xì)胞內(nèi)MSTN基因沉默的研究及脫靶效應(yīng)的檢測(cè)。采集胎齡60d的山羊胎兒,利用組織塊培養(yǎng)法結(jié)合胰蛋白酶消化法分離純化得到GFF細(xì)胞,細(xì)胞性別鑒定為雌性,繪制的生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞增殖特性正常,轉(zhuǎn)染效率為80%,符合轉(zhuǎn)基因克隆的基本要求。細(xì)胞抗性試驗(yàn)確定殺稻瘟菌素篩選細(xì)胞的最佳濃度為10～12μg/mL。將miRNA-1和miRNA-3克隆到載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR上,得到熒光型干擾載體pDG-miRNA,其中GFP作為報(bào)告基因能夠監(jiān)控miRNA表達(dá)。將pDG-miRNA載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFF細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miRNA-1和miRNA-3均能有效抑制MSTN基因的表達(dá),但同時(shí)檢測(cè)到IFN反應(yīng)誘發(fā)基因IFN-β和OAS2的表達(dá)量急劇上升。將pDG-miRNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFF細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)僅miRNA-1能有效抑制MSTN基因的表達(dá),而IFN-β和OAS2的表達(dá)量與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比明顯下降。這些結(jié)果說明免疫刺激引發(fā)的脫靶效應(yīng)隨著導(dǎo)入miRNA的濃度減少而降低,降低miRNA的濃度有利于減少RNAi引起的脫靶效應(yīng)。第三部分SMSC細(xì)胞內(nèi)MSTN基因沉默的研究及脫靶效應(yīng)的檢測(cè)。取山羊胎兒股外側(cè)肌,采用膠原酶和胰蛋白酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法分離純化SMSC細(xì)胞。由于SMSC細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)容易分化和融合形成肌管結(jié)構(gòu),所以該細(xì)胞原代培養(yǎng)48h后及時(shí)地做細(xì)胞傳代并嚴(yán)格控制細(xì)胞密度。通過Desmin蛋白的免疫熒光染色和融合形成肌管的方法,鑒定SMSC細(xì)胞具有較高的純度以及成肌特性。SMSC細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為70%,符合基因沉默試驗(yàn)的基本要求。將pDG-miRNA載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMSC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)miRNA-1和miRNA-3均能有效抑制MSTN基因的表達(dá),但也檢測(cè)到IFN反應(yīng)誘發(fā)基因Mx1、IFI44和STAT1的表達(dá)量均顯著上升。這些結(jié)果說明miRNA-1和miRNA-3在SMSC細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)了免疫應(yīng)激反應(yīng),從而導(dǎo)致脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生。第四部分山羊MSTN基因打靶載體的構(gòu)建及其正負(fù)篩選標(biāo)記的有效性檢測(cè)。利用長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增技術(shù)從山羊基因組中獲得了基因打靶所需的兩個(gè)同源臂,其中5'同源臂長(zhǎng)度為5.2kb,位于5'調(diào)控區(qū)和內(nèi)含子2之間;3'同源臂長(zhǎng)度為1.1kb,位于外顯子3和3'調(diào)控區(qū)。將兩片段分別克隆到pMD19-T載體上,進(jìn)行測(cè)序鑒定,與山羊、牛MSTN基因同源性分別為99.7%、95%,說明擴(kuò)增片段確實(shí)是山羊MSTN基因,完全可以用于基因打靶載體構(gòu)建。將兩個(gè)同源臂分別將其克隆到載體ploxPneo上,得到含有正負(fù)篩選標(biāo)記基因Neo和Tk的打靶載體ploxPneo-MSTN,進(jìn)行PCR、酶切鑒定及相應(yīng)DNA序列測(cè)定,證實(shí)MSTN基因打靶載體構(gòu)建成功。將打靶載體用NotⅠ酶線性化后轉(zhuǎn)染GFF細(xì)胞,分別利用G418(600μg/mL),G418(600μg/mL)/GCV(2μM)進(jìn)行抗性細(xì)胞克隆篩選,對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,證實(shí)了Neo和Tk基因的有效性.第五部分山羊GFF細(xì)胞的基因打靶與中靶細(xì)胞克隆的檢測(cè)。進(jìn)行細(xì)胞G418毒性試驗(yàn),藥物篩選濃度以7d內(nèi)細(xì)胞全部死亡為標(biāo)準(zhǔn),確定了G418篩選細(xì)胞的最佳濃度為700μg/mL。將線性化的ploxPneo-MSTN通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染整合到GFF細(xì)胞基因組的MSTN基因座上,利用G418和GCV對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行藥物篩選和單克隆分離,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,獲得狀態(tài)良好的抗性細(xì)胞克隆247個(gè)。對(duì)抗性細(xì)胞克隆進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定,最終得到1個(gè)打靶陽性細(xì)胞克隆,經(jīng)計(jì)算,基因打靶的絕對(duì)效率是7.1×10~(-9),基因打靶的相對(duì)效率是4.1×10~(-3)。
[Abstract]:In this study , we selected goat MSTN gene as the research object to investigate the effect of target gene function and its expression and regulation . The expression of MSTN gene was detected by means of fluorescence intensity analysis , qPCR and western blot . The results showed that both miRNA - 1 and miRNA - 3 could effectively inhibit the expression of MSTN gene . The results showed that miRNA - 1 and miRNA - 3 could effectively inhibit the expression of MSTN gene . Using G418 ( 600 渭g / mL ) , G418 ( 600 渭g / mL ) / G26 ( 2 渭M ) , the selection of cell clones was performed . The results showed that the optimal concentration was 700 渭g / mL .
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;S827

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本文編號(hào)：1911608