發(fā)布時(shí)間：2021-03-26 22:08

  絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine Proteinase Inhibitor,SPI)是一類(lèi)對(duì)絲氨酸蛋白酶活性有抑制作用的蛋白質(zhì)超家族,不但能夠通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶活性影響蛋白質(zhì)代謝從而參與凝血、補(bǔ)體活化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移及纖溶等許多生理和病理過(guò)程,而且也是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,起免疫增強(qiáng)和抑制作用的同時(shí)也能引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答。隨著人蛔蟲(chóng)、馬來(lái)絲蟲(chóng)、豬蛔蟲(chóng)、鉤蟲(chóng)、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)、異尖線蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、華枝睪吸蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)和細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶抑制劑不斷被分離鑒定,證明SPI是寄生蟲(chóng)與宿主間相互作用的重要分子。Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Kazal-type Serine Protease Inhibitor,Ka SPI)是較為保守的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族之一,結(jié)構(gòu)上因含有Kazal型結(jié)構(gòu)域而與絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的其他成員相區(qū)別,但是在功能上KaSPI與絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的其他成員卻具有相似性。目前研究范圍較廣的Ka SPI多見(jiàn)于水產(chǎn)動(dòng)物,如中國(guó)對(duì)蝦、克氏原螯蝦、扇貝、蟹類(lèi)等,Ka SPI對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物的抑菌性有重要意義。目前,對(duì)旋毛蟲(chóng)Ka SPI(TsKa SPI)的研究還未見(jiàn)到,所以研究Ts Ka SPI不僅可以為進(jìn)一步深入研究SPI參與蟲(chóng)體與宿主之間相互作用提供理論依據(jù),而且為防治旋毛蟲(chóng)病奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本文根據(jù)Gen Bank上Ts KaSPI的基因編碼序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物,提取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到c DNA后作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,然后將所獲PCR產(chǎn)物克隆至p EASY-T1載體后轉(zhuǎn)入克隆感受態(tài)Tans5α,經(jīng)過(guò)PCR和Eco R I、Xho I雙酶切鑒定后進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果顯示克隆的序列由852個(gè)核苷酸組成,編碼283個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果顯示Ts Ka SPI具有Kazal-FS結(jié)構(gòu)域,不僅具有Kazal型結(jié)構(gòu)域而且具有卵泡抑素結(jié)構(gòu)域,具備Ka SPI的特點(diǎn)。本文利用原核表達(dá)載體p ET-30a(+)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-Ts Ka SPI,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析所得融合蛋白主要以包涵體形式存在,融合蛋白的分子量約為38KDa,與預(yù)測(cè)的理論值相符。包涵體蛋白經(jīng)過(guò)電洗脫進(jìn)行純化,然后將純化蛋白進(jìn)行透析復(fù)性,所獲純化的重組蛋白經(jīng)Western Blot分析,結(jié)果顯示該蛋白可以被感染旋毛蟲(chóng)小鼠陽(yáng)性血清所識(shí)別。將純化的重組蛋白腹腔注射到小鼠體內(nèi)檢測(cè)免疫保護(hù)性,旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率為38.3%。間接ELISA法檢測(cè)血清抗體水平,結(jié)果顯示重組蛋白免疫小鼠誘導(dǎo)抗體Ig G水平顯著高于對(duì)照組和佐劑組小鼠。復(fù)性的重組蛋白與部分蛋白酶作用,結(jié)果顯示所獲得的復(fù)性蛋白可以抑制凝血酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶G、彈性蛋白酶、糜蛋白酶及顆粒酶B的活性,并且重組蛋白濃度越高抑制效果越好。將純化蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體,利用多克隆抗血清進(jìn)行免疫印跡及免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn),免疫印跡結(jié)果顯示多克隆抗血清作為抗體可以識(shí)別重組蛋白并與之結(jié)合,說(shuō)明該重組蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性;免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn)結(jié)果顯示Ts Ka SPI在旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)時(shí)期有所表達(dá)并分布于蟲(chóng)體表面和內(nèi)部。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q78;S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳秀萍,付寶權(quán),劉明遠(yuǎn),張亞蘭,原麗紅,李蓮瑞,盧強(qiáng),Pascal Boireau;旋毛蟲(chóng)新生幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的免疫篩選[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2004年04期

本文編號(hào)：1884750