發(fā)布時間：2018-05-09 02:24

  本文選題：環(huán)二核苷酸合成酶 + 載體構(gòu)建��； 參考：《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：環(huán)二核苷酸(Cyclic di-nucleotides)是目前發(fā)現(xiàn)的重要的第二信使分子。研究表明它們能傳遞多種細(xì)胞外的不同信息,調(diào)節(jié)大量不同的生理生化過程,如細(xì)菌的生物膜形成和宿主天然免疫應(yīng)答,可用于免疫治療、免疫預(yù)防或疫苗佐劑用于人和動物的臨床研究。鑒于環(huán)二核苷酸的重要功能及其應(yīng)用價值,本試驗對10種環(huán)二核苷酸合成酶基因進行原核表達(dá)載體構(gòu)建及體外誘導(dǎo)表達(dá),以期為c-GAMP及c-di-GMP體外合成及疫苗佐劑研究奠定基礎(chǔ)。首先,本試驗通過對10個不同物種來源的環(huán)二核苷酸合成酶基因及丙酸誘導(dǎo)型載體的多克隆位點的核苷酸序列進行分析,設(shè)計BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶位點用于10個不同物種環(huán)二核苷酸合成酶丙酸誘導(dǎo)型載體構(gòu)建;PCR擴增和酶切獲取10個不同物種環(huán)二核苷酸合成酶基因的線性片段后,用T4連接酶將10個基因與相同雙酶切處理的載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3);利用雙酶切及測序的方法鑒定重組質(zhì)粒;構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒經(jīng)丙酸鈉誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白的表達(dá);對有重組蛋白表達(dá)的菌體超聲破碎,取上清樣品進行Western blot分析鑒定重組蛋白是否為可溶性表達(dá)。試驗結(jié)果表明成功構(gòu)建了10個不同物種的環(huán)二核苷酸合成酶基因的丙酸誘導(dǎo)型原核表達(dá)重組質(zhì)粒,8個重組質(zhì)粒在BL21中有表達(dá)且為可溶性表達(dá)。其次,利用Ni-NTA Agarose親和純化霍亂弧菌環(huán)二核苷酸合成酶VC0179重組蛋白并用TEV酶切獲取靶蛋白。體外酶促反應(yīng)檢測VC0179重組蛋白的功能活性,高效液相色譜檢測體外合成產(chǎn)物。試驗結(jié)果顯示Ni-NTA Agarose純化后獲得了高純度的VC0179重組蛋白,并且在TEV酶的作用下可將融合標(biāo)簽切除,獲得VC0179靶蛋白;體外酶促反應(yīng)證實該重組蛋白具有功能活性,可在體外一步法生成c-di-GMP。以上試驗結(jié)果表明本試驗為c-GAMP和c-di-GMP后續(xù)的體外合成及佐劑功能研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Cyclic dinucleotidesis an important second messenger molecule found at present. Studies have shown that they can transmit a variety of extracellular information, regulate a large number of different physiological and biochemical processes, such as bacterial biofilm formation and host innate immune response, and can be used in immunotherapy. Immune prophylaxis or vaccine adjuvants are used in clinical studies in humans and animals. In view of the important function of cyclic dinucleotide and its application value, we constructed the prokaryotic expression vector and induced expression of 10 cyclic dinucleotide synthase genes in vitro, in order to lay a foundation for the in vitro synthesis of c-GAMP and c-di-GMP and the study of vaccine adjuvant. First of all, the nucleotide sequences of the polyclonal sites of 10 different species derived cyclodinucleotide synthase genes and propionic acid inducible vectors were analyzed. Two restriction endonuclease sites, BamH 鈪，

本文編號：1864159