本文選題：plcR + 炭疽芽胞桿菌　； 參考：《海南大學》2015年碩士論文

【摘要】：PlcR是蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌中十分重要的多效調(diào)控因子,多種毒力因子編碼基因的表達都由它激活,例如磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。改變plcR基因的序列可使蠟樣芽胞桿菌與蘇云金芽胞桿菌中的溶血素和細胞毒素的表達與活性減弱。比較基因組學顯示,炭疽芽胞桿菌中的plcR基因序列是與蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌同源的,但plcR基因在炭疽芽胞桿菌當中發(fā)生了一個無義突變,導致在炭疽芽胞桿菌中PlcR不能夠正常表達。為了研究plcR基因對炭疽芽胞桿菌功能的影響,本研究主要以蠟樣芽胞桿菌CMCC63301基因組為模板構建了pBE2A/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-papR/A16R、 pBE2A/B17DD、 pBE2A-plcR/B17DD、 pBE2A-plcRpapR/B17DD、 pBE2A-papR/B17DD、pBE2A-FplcRpapR/B17DD十個菌株對其進行表型分析,對其中的pBE2A/A16R、 pBE2A-plcR/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-plcRpapR/A16R、pBE2A-papR/A16R進行了蛋白質組學研究,并單獨對pBE2A/A16R、 pBE2A-plcR/A16R及pBE2A-FlcRpapR/Al6R中的atxA、 sph、 plc三個基因在轉錄水平上進行了研究。結果顯示,單獨將papR和plcRpapR全基因序列導入炭疽芽胞桿菌后重組菌株pBE2A-plcRpapR/A16R、 pBE2A-papR/A16R、 pBE2A-plcRpapR/B17DD、 pBE2A-papR/B17DD與重組菌株pBE2A/A16R、 pBE2A/B17DD一樣其溶血活性及卵磷脂酶活性均沒有恢復。重組菌株pBE2A-plcR/A16R、 pBE2A-plcR/B17DD的溶血活性沒有恢復,恢復了部分卵磷脂酶活性,而pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/B17DD重組菌株的溶血酶活性及卵磷脂酶活性均恢復。表明將蠟樣芽胞桿菌的plcR單獨基因導入炭疽芽胞桿菌后,可以直接激活部分卵磷脂酶活性,但不能激活溶血酶活性；將融合基因FplcRpapR導入炭疽芽胞桿菌后,溶血酶及卵磷脂酶活性均恢復,但pBE2A-FplcRpapR/A16R重組菌株的溶血活性沒有pBE2A-FplcRpapR/B17DD穩(wěn)定。PlcR蛋白的表達受自身所調(diào)控,其較為保守的N端,屬于DNA結合區(qū)域,在plcR調(diào)控基因的啟動子區(qū)域存在高度保守的回文序列TATGNANNNNTNC ATA,我們推測他可能構成了plcR的識別位點(即PlcR-box),根據(jù)該回文序列我們查找出92個可能受PlcR調(diào)控的蛋白,通過對pBE2A/A16R、 pBE2A-plcR/A16R、 pBE2A-FplcRpapR/A16R、 pBE2A-plcRpapR/A16R、 pBE2A-papR/A16R蛋白質組學的研究,在我們查找的差異蛋白中有4個蛋白是受PlcR調(diào)控的。在轉錄水平上分析了atxA和plc、 sph等與溶血素、卵磷脂酶相關的基因,plc、 sph基因的相對表達量與溶血活性及卵磷脂酶活性呈正相關,atxA基因的相對表達量與芽胞形成率呈負相關,雖然單獨導入plcR和FplcRpapR均不影響芽胞的形成,但影響A16R的芽胞形成率,在重組菌株pBE2A-plcR/A16R與pBE2A-IFplcRpapR/A16R中其芽胞形成率均降低。
[Abstract]:PlcR is a very important regulatory factor in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. The expression of a variety of virulence factor encoding genes are activated by it, such as phospholipase, protease, and hemolysin. The expression of hemolysin and cytotoxin in Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis can be expressed by changing the sequence of plcR gene. The comparative genomics showed that the plcR gene sequence in Bacillus anthracis was homologous with Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis, but the plcR gene had a nonsense mutation in Bacillus anthracis, causing PlcR to not normally express in Bacillus anthracis. In order to study the anthrax bud of the plcR gene In this study, ten strains of Bacillus cereus CMCC63301 genome were used to construct pBE2A/A16R, pBE2A-FplcRpapR/A16R, pBE2A-papR/A16R, pBE2A/B17DD, pBE2A-plcR/B17DD, pBE2A-plcRpapR/B17DD, pBE2A-papR/B17DD, pBE2A-FplcRpapR/B17DD, for phenotype analysis, and pBE2A/A16R, pB. E2A-plcR/A16R, pBE2A-FplcRpapR/A16R, pBE2A-plcRpapR/A16R, pBE2A-papR/A16R were studied in proteomics, and the three genes of atxA, SPH, PLC in pBE2A/A16R, pBE2A-plcR/A16R and pBE2A-FlcRpapR/Al6R were studied at the transcriptional level. The results showed that the sequence of papR and plcRpapR whole genes was introduced into the anthrax bud separately. The hemolytic activity and lecithin activity of the recombinant strain pBE2A-plcRpapR/A16R, pBE2A-papR/A16R, pBE2A-plcRpapR/B17DD, and pBE2A-papR/B17DD did not recover as the recombinant strain pBE2A/A16R, pBE2A/B17DD, and the recombinant strain pBE2A-plcR/A16R, the hemolytic activity of pBE2A-plcR/B17DD was not restored, and some of the phosphatidylase activity was restored. The lysozyme activity and the lecithin activity of the recombinant strain of pBE2A-FplcRpapR/A16R and pBE2A-FplcRpapR/B17DD all recovered. It showed that the activity of some lecithin could be activated directly after the introduction of the plcR single gene of Bacillus cereus into Bacillus anthracis, but it could not activate the activity of the lysozyme; the fusion gene FplcRpapR was introduced into the anthrax. After bacillus, the activity of lysozyme and lecithin was recovered, but the hemolytic activity of the pBE2A-FplcRpapR/A16R recombinant strain was not regulated by pBE2A-FplcRpapR/B17DD stable.PlcR protein, and its more conservative N end, belonging to the DNA binding region, was highly conserved in the promoter region of the plcR regulation gene. NNNNTNC ATA, we speculate that he might constitute the plcR identification site (PlcR-box), according to which we find 92 proteins that may be regulated by PlcR, through the study of pBE2A/A16R, pBE2A-plcR/A16R, pBE2A-FplcRpapR/A16R, pBE2A-plcRpapR/A16R, pBE2A-papR/ A16R proteomics, in the difference protein we find. 4 proteins were regulated by PlcR. At the transcriptional level, atxA and PLC, SPH and other genes related to hemolysin, lecithin, PLC, SPH genes were positively correlated with the hemolytic activity and the activity of lecithin. The relative expression of the atxA gene was negatively correlated with the rate of bud formation, although both plcR and FplcRpapR were introduced alone. However, the spore formation rate of A16R was lower than that of pBE2A-plcR/A16R and pBE2A-IFplcRpapR/A16R.

【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：1863303