本文選題：抗病毒miRNAs + 豬呼吸道上皮細(xì)胞��； 參考：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：豬呼吸系統(tǒng)疾病(Swine respiratory diseases,SRD)嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展,它的致病機(jī)理復(fù)雜,可以由一種或多種病毒、細(xì)菌、寄生蟲引起,也可隨著環(huán)境、營養(yǎng)、應(yīng)激和豬只自身健康程度的變化而改善或加重。病毒是SRD的主要病原菌之一,天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR)與病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)相互作用,識別病毒并啟動相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,啟動合成干擾素、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子及一系列下游抗病毒相關(guān)分子,抑制病毒在體內(nèi)的增殖。上皮細(xì)胞不僅是病原微生物入侵呼吸道的物理屏障,還能啟動天然免疫反應(yīng)抵御病毒入侵,是防御呼吸道疾病的第一道屏障。miRNAs是生物體內(nèi)的一類長度約21~25nt的非編碼小RNA,通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)而參與各項(xiàng)生命活動,已有研究表明miRNAs與機(jī)體的疾病抗性/易感性密切相關(guān)。解析呼吸道上皮細(xì)胞抗病毒天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制,鑒定抗病毒相關(guān)miRNAs及其作用,是防治呼吸道疾病的關(guān)鍵。大多數(shù)病毒的PAMP是雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA),人工合成的ds RNA Poly(I:C)能夠有效地激活機(jī)體的抗病毒天然免疫反應(yīng)。因此,本研究利用Poly(I:C)刺激原代培養(yǎng)的豬呼吸道上皮細(xì)胞,通過高通量測序技術(shù)分析對照組和刺激組miRNAs的表達(dá)和編輯情況、鑒定新miRNAs,在此基礎(chǔ)上,選擇感興趣的miRNAs進(jìn)行靶基因鑒定和誘導(dǎo)表達(dá)、組織表達(dá)分析,并分析了miR-20a對細(xì)胞生長、遷移、自噬及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響,得到的主要結(jié)果如下:(1)利用組織塊原代培養(yǎng)法和差速貼壁純化法,成功獲得了豬呼吸道上皮細(xì)胞,經(jīng)角蛋白CK18單克隆抗體鑒定,確定為上皮類型的細(xì)胞,且純度較高。(2)經(jīng)HiSeq高通量測序,對照組和處理組各得到13,339,772和11,987,962條純凈序列,序列長度集中在18~26 nt之間,峰值位于22 nt;獲得差異表達(dá)顯著的miRNAs 23個(p0.01,│log2ratio│1),其中19個在Poly(I:C)刺激下下調(diào)表達(dá),4個上調(diào)表達(dá)。利用MIRANDA、TARGETSCAN和PICTAR三個軟件,共同預(yù)測到386個基因是差異表達(dá)的miRNAs潛在靶序列,這些靶基因主要富集在細(xì)胞生長調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的正負(fù)調(diào)控、胚胎發(fā)育、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等生物過程方面(p0.05)。(3)隨機(jī)選取兩個差異表達(dá)miRNAs(miR-101和miR-20a),利用雙熒光素酶報告基因分析和定點(diǎn)突變方法對生物信息學(xué)預(yù)測的潛在靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-101能有效地抑制所選取的所有潛在靶基因(SOX9,TLK2,RANBP9,BCL9,EZH2,SOCS5,CDH11和DR1)的表達(dá),在選取的8個潛在靶基因中,miR-20a能對其中的5個(HLF,ITGB8,ARID4B,SLC40A1和MAP3K2)進(jìn)行調(diào)控,對ENNP5,FBXL5和GPR6基因的表達(dá)無影響。(4)測序表明miRNAs中存在大量的堿基編輯現(xiàn)象,處理組和對照組分別有78和87個miRNAs發(fā)生編輯,占所檢測到miRNAs總數(shù)的57.35%和62.14%,堿基編輯包含所有的堿基替代類型,其中以AG堿基編輯形式最多,在對照組和處理組中分別占27.89%和29.38%,其次為GA(12.2%和12.59%)和GT(11.39%和11.9%)。Poly(I:C)處理對堿基編輯產(chǎn)生一定的影響:對照組和處理組中各存在14種和5種特有的堿基編輯現(xiàn)象;miRNAs成熟序列5’端第5個堿基的編輯也在對照組和處理組中表現(xiàn)出差異。雙熒光素酶報告基因和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明,第5個堿基編輯對miRNAs識別和結(jié)合靶基因具有重要影響,當(dāng)突變掉第5個堿基(G/T)后,miR-101失去了對靶基因的識別、結(jié)合能力。(5)在處理組和對照組中分別檢測到83條和82條新的miRNAs,其中47個在兩組中共同存在。物種間保守性分析顯示,共有19個新miRNAs可以在其他物種中找到同源序列,隨機(jī)選取其中的6個新miRNAs(NS-1、NS-2、NS-3、NS-6、NS-8和NS-9)進(jìn)行克隆測序,證明了這些miRNAs確實(shí)存在于豬中。誘導(dǎo)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),NS-2、NS-8和NS-9在不同濃度Poly(I:C)刺激下表達(dá)量變化顯著(p0.05);組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),NS-2、NS-8和NS-9在1月齡民豬13個組織中(心、肝、脾、肺、腎、胃、舌、膀胱、小腸、大腸、脂肪、背最長肌和皮膚)均表達(dá),但表達(dá)模式各不相同。(6)細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn)證明,過表達(dá)miR-20a可以縮短pk15細(xì)胞在生長遲緩區(qū)停留的時間,提前進(jìn)入對數(shù)生長階段,顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖(p0.05),抑制miR-20a的表達(dá)會顯著減緩細(xì)胞的增殖(p0.05);細(xì)胞劃痕試驗(yàn)證明過表達(dá)miR-20a后,各觀測時間點(diǎn)pk15細(xì)胞的相對遷移率均顯著高于對照組(p0.05),抑制miR-20a的表達(dá)會顯著降低細(xì)胞的遷移率(p0.05)。(7)Real-time PCR檢測miR-20a對5個細(xì)胞因子(IFN-β、IL-29、IL1-β、IL-6和IL-10)表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pk15細(xì)胞中過表達(dá)miR-20a,可以顯著抑制這些基因的表達(dá)(p0.05),抑制miR-20a的表達(dá),可以顯著促進(jìn)這些基因的表達(dá)(p0.05)。(8)利用血清饑餓法誘導(dǎo)pk15細(xì)胞發(fā)生自噬,研究miR-20a對細(xì)胞自噬的影響,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-20a后,自噬標(biāo)記蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)顯著降低(p0.05);抑制miR-20a的表達(dá)后,LC3Ⅱ的表達(dá)顯著升高(p0.05)。
[Abstract]:鐚懠鍚哥郴緇熺柧鐥，

本文編號：1850923