本文選題：熱應激 + 錳��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文

【摘要】：本論文以原代培養(yǎng)肉雞雞胚心肌細胞為模型進行了五個體外試驗,研究錳對雞胚心肌細胞的抗熱應激效應及其分子機制,為緩解熱應激對肉雞等家禽的負面影響提供系統(tǒng)、深入的科學理論依據(jù)。試驗一:構建原代雞胚心肌細胞模型并測定心肌細胞持續(xù)活力。運用細胞培養(yǎng)技術、通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)以及經(jīng)免疫組化鑒定心肌細胞,成功構建了原代雞胚心肌細胞模型。通過測定細胞培養(yǎng)液中的酶活力,間接評價雞胚心肌細胞活力,為后續(xù)試驗提供活力較好且穩(wěn)定的細胞模型奠定基礎。模型構建方面,雞胚心肌組織用0.12%膠原酶II 37℃消化8 min,800 r/min離心5 min分離細胞,收集細胞并用培養(yǎng)液重懸,經(jīng)2次差速貼壁純化后的心肌細胞接種在6孔培養(yǎng)板上,并在40℃、95%空氣和5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)的原代雞胚心肌細胞生長快速、活躍,培養(yǎng)24 h后可觀察到心肌細胞有明顯的自律性搏動,72 h后達到95%的匯合,可作為研究雞胚心肌細胞體外模型。心肌細胞持續(xù)活力測定方面,細胞培養(yǎng)液中的肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST)酶活均受到培養(yǎng)時間的影響(P0.05)。CK和LDH酶活有著相似的趨勢,在第6天酶活最低,之后逐漸升高。AST酶活隨培養(yǎng)時間的延長而增加且在第9天達到最大。心肌細胞的活力可持續(xù)6天,之后酶活隨培養(yǎng)時間的延長而降低。試驗二:研究熱應激對原代培養(yǎng)雞胚心肌細胞的影響,旨在確定原代培養(yǎng)雞胚心肌細胞受到熱應激影響的最佳時間點。采用2×5兩因子完全隨機設計。試驗設2個培養(yǎng)溫度(40℃常溫和44℃高溫)和5個作用時間(1、2、4、6和8 h),共10個處理,每個處理6個重復。在高溫條件下,雞胚心肌細胞培養(yǎng)液中CK、LDH和AST的酶活性顯著(P0.05)升高,表明心肌細胞結構的完整性發(fā)生了改變。在高溫條件下,與常溫相比,高溫極顯著的(P0.05)上調(diào)了心肌細胞HSF1、HSF2 mRNA、HSP70和HSP90基因表達。心肌細胞中HSP70和HSP90 mRNA的表達先升高、后降低,且分別在2 h和4 h時達到最大。HSP70和HSP90蛋白表達隨熱應激時間的延長而升高。面對高溫熱應激,心肌細胞HSP70和HSP90 mRNA比其相應的蛋白表達反應更靈敏。以上結果表明,HSP70和HSP90基因在體外培養(yǎng)原代雞胚心肌細胞內(nèi)的表達對熱應激敏感,在雞胚心肌細胞對抗或緩解熱應激損傷中發(fā)揮重要作用。最后,熱應激處理2 h和4 h為心肌細胞最佳熱應激持續(xù)時間點,為后續(xù)試驗四熱應激處理時間點提供了試驗依據(jù)。試驗三:研究錳水平對原代培養(yǎng)雞胚心肌細胞mnsod活性及其基因表達的影響,旨在確定原代培養(yǎng)雞胚心肌細胞最佳錳加添水平及孵育時間。采用5×3兩因子完全隨機試驗設計,設5個錳添加水平(0、0.5、1、2和4mm氯化錳形態(tài)的錳)與3個錳孵育時間(12、24和48h),共15個處理,每個處理6個重復。錳水平和孵育時間對雞胚心肌細胞mnsod酶活有極顯著的互作效應(p0.05)。在12h時,錳水平對mnsod酶活性沒有影響(p0.05),而在24h和48h時,與對照組和0.5mmmn相比,1mmmn顯著提高了mnsod酶活性(p0.05)。mnsodmrna表達水平上,錳和孵育時間均提高了mnsodmrna基因的表達(p0.05)。與對照組相比,添加1mm錳顯著(p0.05)提高了心肌細胞mnsodmrna表達。與作用12h相比,作用24和48h均上調(diào)了(p0.05)mnsodmrna基因的表達。以上結果表明,在雞胚心肌細胞中,錳誘導的mnsod基因表達的調(diào)控可能發(fā)生在轉錄和翻譯后水平,或者通過修飾合成的mrna和蛋白的穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。結合上述結果,選取1mm錳添加水平并孵育48h,為試驗四心肌細胞錳處理濃度和孵育時間提供了試驗依據(jù)。試驗四:研究錳對原代培養(yǎng)雞胚心肌細胞的抗氧化性能及熱休克蛋白/因子的影響,以揭示錳對雞胚心肌細胞的抗熱應激效應及其分子機制。試驗采用2×3×2三因子完全隨機設計。設2個雞胚心肌細胞培養(yǎng)溫度(40℃常溫和44℃高溫)、3個錳處理(不添加錳、添加1.0mm氯化錳形態(tài)的錳以及1.0mm中等絡合強度有機錳形態(tài)的錳)與2個熱應激處理時間點(2h與4h),共12個處理,每個處理6個重復。高溫熱應激顯著提高了(p0.05)心肌細胞mnsod酶活,mnsod、hsp70、hsp90、hsf1、hsf2和hsf3mrna表達,hsp70蛋白表達,表明熱應激引起了心肌細胞氧化損傷。與對照組相比,細胞培養(yǎng)液中加無機錳和有機錳均提高了(p0.05)心肌細胞mnsod酶活性,且有機錳顯著的(p0.05)高于無機錳。在mnsod基因表達方面,錳源與培養(yǎng)溫度有極顯著(p0.05)的互作效應。在常溫條件下,無機錳和有機錳均提高了(p0.05)心肌細胞mnsod基因表達。在高溫熱應激條件下,與對照組和無機錳組相比,有機錳顯著的(p0.05)上調(diào)了心肌細胞mnsodmrna表達。加錳特別是有機錳顯著的(p0.05)增加了mnsod蛋白表達。錳源與培養(yǎng)溫度的交互作用顯著的(p0.05)影響了hsp70基因的表達和hsp90mrna表達。在常溫條件下,錳對hsp70基因表達和hsp90mrna表達無影響(p0.05)。在高溫熱應激條件下,無機錳和有機錳均下調(diào)了(p0.05)hsp70和hsp90mrna表達,且有機錳的下調(diào)程度顯著(P0.05)高于無機錳。不論無機錳還是有機錳均降低了(P0.05)HSP70蛋白表達。然而,加錳顯著地提高了(P0.05)HSP90蛋白表達。以上結果表明,細胞培養(yǎng)液中加錳特別是中等絡合強度有機錳可提高心肌細胞抗氧化能力,降低熱應激引起的氧化損傷。試驗五:研究錳對原代培養(yǎng)雞胚心肌細胞表觀遺傳的影響。試驗設計同試驗四。加無機錳和有機錳均降低了(P0.05)心肌細胞MnSOD和HSP70啟動子區(qū)DNA甲基化水平,可能與其MnSOD mRNA高表達有關。高溫組上調(diào)了(P0.05)心肌細胞gga-miR-34c-5p,gga-miR-29c-3p表達,下調(diào)了(P0.05)gga-miR-10a-5p,gga-miR-10b-5p,gga-miR-125b-5p表達。無機錳和有機錳均上調(diào)了(P0.05)心肌細胞ggamiR-142-5p,gga-miR-34b-5p,gga-miR-34c-5p,gga-miR-29c-3p,gga-mi R-10a-5p,gga-miR-10b-5p,gga-mi R-125b-5p表達。以上結果表明,錳可通過修飾特定基因啟動子區(qū)DNA甲基化程度以及相應的miRNA表達以調(diào)控靶基因的表達及其相關通路來緩解高溫應激造成的氧化損傷。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞培養(yǎng)液中加錳、特別是中等絡合強度有機錳,可提高心肌細胞抗氧化能力,有效緩解熱應激引起的氧化損傷,而且錳可引起心肌細胞特定基因啟動子區(qū)DNA甲基化和miRNA表觀遺傳變化,并調(diào)控相應的功能基因。
[Abstract]:In this paper , we studied the effects of Mn on the myocardial cells of chicken embryo and the mechanism of its molecular mechanism . The results showed that the activity of CK , LDH and AST in the culture medium of chicken embryo increased with the increase of culture time . The results showed that the activity of CK , LDH and AST in the culture medium of chicken embryo increased with the increase of culture time . The effects of manganese on the activity of mnsod and its molecular mechanism were studied . The results showed that the effect of Mn on the activity of mnsod and the time of incubation were studied .

【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S831

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本文編號：1836430