本文選題：MTHFR基因 + 堿基突變��； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：MTHFR是一種黃素蛋白,在葉酸代謝過程中起到限速作用,而MTHFR的表達(dá)可能會(huì)影響葉酸代謝繼而影響乳蛋白合成。miRNA與靶基因的結(jié)合可能會(huì)因靶基因3'UTR結(jié)合位點(diǎn)處的突變而發(fā)生改變,進(jìn)而影響基因的表達(dá)。本課題組前期的研究結(jié)果表明,奶山羊MTHFR-3'UTR存在c.2494GA突變。為研究MTHFR基因?qū)θ榈鞍缀铣勺饔玫挠绊?尋找影響MTHFR基因表達(dá)的miRNA顯得尤為重要。本研究利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miRNA-1296和mi RNA-370能夠與野生型(2494G)MTHFR-3'UTR結(jié)合。為了驗(yàn)證c.2494GA突變對(duì)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的影響,本研究克隆了野生型和突變型(2494A)MTHFR-3'UTR,構(gòu)建野生型和突變型psiCHECK?-2-MTHFR-3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體和miRNA mimics共轉(zhuǎn)染到乳腺上皮細(xì)胞中,檢測(cè)雙熒光素酶的相對(duì)表達(dá)量。將miRNA mimics單獨(dú)轉(zhuǎn)染到乳腺上皮細(xì)胞中,檢測(cè)MTHFR蛋白的表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:1、奶山羊MTHFR-3'UTR區(qū)的克隆、測(cè)序分析及重組載體的構(gòu)建利用奶山羊基因組克隆出野生型(2494G)和突變型(2494A)MTHFR-3'UTR,全長(zhǎng)為314bp。構(gòu)建野生型和突變型psiCHECK?-2-MTHFR-3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體,并通過測(cè)序和雙酶切法鑒定。2、奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定采集不同基因型的奶山羊乳腺組織(野生型和突變型),利用組織塊貼壁法培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞,經(jīng)過3-5次傳代得到純化的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞,并對(duì)培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3、mi RNA對(duì)野生型和突變型重組載體熒光素酶表達(dá)的影響將重組載體psiCHECK?-2-MTHFR-3′UTR與miR-370、miR-1296通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,用miRNA-370與重組載體共同轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞時(shí),psiCHECK?-2-MTHFR-3′UTR-2494G熒光素酶活性顯著低于psiCHECK?-2-MTHFR-3′UTR-2494A。mi R-1296對(duì)重組載體psiCHECK?-2-MTHFR-3′UTR的熒光素酶活性沒有影響。結(jié)果表明,MTHFR-3'UTR c.2494GA的突變改變了miRNA-370的結(jié)合位點(diǎn)。4、miRNA-370對(duì)MTHFR基因表達(dá)的影響利用Western blot的方法檢測(cè)MTHFR蛋白在不同基因型乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。miRNA-370轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞后,抑制野生型乳腺上皮細(xì)胞中MTHFR蛋白的表達(dá),但對(duì)突變型沒有影響。
[Abstract]:MTHFR is a kind of flavin protein, which plays a rate-limiting role in folic acid metabolism, and the expression of MTHFR may affect folic acid metabolism and then affect the binding of milk protein synthesis. MiRNAs to target gene may be changed by mutation of target gene 3'UTR binding site. And then affect the gene expression. The results of our previous study showed that there was a c.2494GA mutation in dairy goat MTHFR-3'UTR. In order to study the effect of MTHFR gene on the synthesis of lactoprotein, it is very important to find the miRNA that affects the expression of MTHFR gene. In this study, bioinformatics analysis showed that miRNA-1296 and mi RNA-370 could be combined with wild type MTHFR-3UTR. In order to verify the effect of c.2494GA mutation on miRNA binding site, wild and mutant psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR double luciferase reporter vectors were cloned and cloned. The recombinant vector and miRNA mimics were co-transfected into mammary epithelial cells by liposome transfection to detect the relative expression of double luciferase. MiRNA mimics was transfected into breast epithelial cells to detect the expression of MTHFR protein. The main results were as follows: 1. Cloning, sequencing and construction of MTHFR-3'UTR region of dairy goat. The wild type was cloned from the genome of dairy goat, the wild type was cloned from the wild type (2494 G) and the mutant type was identified as MTHFR-3 UTR.The total length of the clone was 314bp. Wild type and mutant psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR double luciferase report vector was constructed. The mammary epithelial cells of dairy goats were identified by sequencing and double enzyme digestion. The mammary gland tissues (wild type and mutant type) of different genotypes were collected and the mammary epithelial cells of dairy goats were cultured by tissue mass adherence method. The purified mammary epithelial cells of dairy goats were obtained after 3-5 passages. The expression of luciferase in wild-type and mutants of mammary epithelial cells was identified. The recombinant vector psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR and miR-370 miR-1296 were co-transfected into dairy goat mammary epithelial cells by liposome. The relative expression of luciferase was detected. The results showed that the luciferase activity of psiCHECK-2-MTHFR-3UUTR-2494G was significantly lower than that of psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR-2494A.mi R-1296 on the luciferase activity of the recombinant vector psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR. The results showed that the luciferase activity of the recombinant vector psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR was significantly lower than that of psiCHECK?-2-MTHFR-3'UTR-2494A.mi R-1296. The results showed that the mutation of MTHFR-3 UTR c.2494GA changed the effect of miRNA-370 binding site .4miRNA-370 on the expression of MTHFR gene. The expression level of MTHFR protein in breast epithelial cells with different genotypes was detected by Western blot method. MiRNA-370 was transfected into mammary epithelial cells. The expression of MTHFR protein in wild-type mammary epithelial cells was inhibited, but no effect on mutant type was observed.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827

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本文編號(hào)：1835965