發(fā)布時(shí)間：2018-05-02 21:39

  本文選題：小鼠 + DNA識(shí)別受體�。� 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：天然免疫是宿主抵御病原感染的第一道防線,機(jī)體通過(guò)自身胚系編碼的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),激活一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),引發(fā)Ⅰ型干擾素(interferons, IFNs)、炎癥因子(inflammatory factors)、趨化因子(chemokines)等的釋放,從而激發(fā)機(jī)體的抗病原天然免疫反應(yīng),最終清除病原。病毒的基因組DNA或轉(zhuǎn)錄中間產(chǎn)物是一類重要的PAMPs,因此病毒的DNA如何被機(jī)體PRRs識(shí)別是宿主能否抵御DNA病毒感染的關(guān)鍵。本研究在克隆小鼠Toll樣受體8(TLR8)、小鼠Toll樣受體9 (TLR9)、DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活物(DAD、黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)和富亮氨酸重復(fù)序列互作蛋白1 (LRRFIP1)五種天然免疫DNA模式識(shí)別受體的基礎(chǔ)上,對(duì)其遺傳進(jìn)化關(guān)系和分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,對(duì)模式識(shí)別受體的功能進(jìn)行了初步研究,為深入研究機(jī)體抗感染免疫機(jī)制和病原免疫逃逸機(jī)制等宿主與病原互作奠定了基礎(chǔ)。本研究取得的主要進(jìn)展如下：1.成功克隆和鑒定了5種小鼠DNA識(shí)別受體基因。采用RT-PCR技術(shù)分別從小鼠外周血淋巴細(xì)胞中克隆了其TLR8 (mTLR8)和TLR9 (mTLR9)基因,從脾淋巴細(xì)胞中克隆了小鼠DAI(mDAI)、AIM2 (mAIM2)和LRRFIP1 (mLRRFIP1)基因。基因序列分析表明,克隆的mTLR8基因開放閱讀框架(ORF)全長(zhǎng)3099bp,編碼1032個(gè)氨基酸；克隆的mTLR9基因ORF全長(zhǎng)3099bp,編碼1032個(gè)氨基酸：克隆的mDAI基因的ORF全長(zhǎng)1236 bp,編碼411個(gè)氨基酸；克隆的mAIM2基因的ORF全長(zhǎng)1065 bp,編碼354個(gè)氨基酸；克隆的mLRRFIPl基因的ORF全長(zhǎng)2190bp,編碼729個(gè)氨基酸。2.預(yù)測(cè)分析了5種小鼠DNA識(shí)別受體基因分子結(jié)構(gòu)特征及其遺傳演化關(guān)系。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)克隆的基因進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示mTLR8含有胞外的亮氨酸富集(LRRs)區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR區(qū),且LRRs形成螺線管樣的空間結(jié)構(gòu);mTLR9也含有胞外的亮氨酸富集(LRRs)區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR區(qū)mDAI含有兩個(gè)Z-DNA結(jié)構(gòu)域(Za和Zβ)、DNA結(jié)構(gòu)域3(D3)和信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(SD)；mAIM2含有HIN-200結(jié)構(gòu)域和PYD結(jié)構(gòu)域；mLRRFIP1含有兩個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域,并以二聚體的形式存在。遺傳演化分析顯示,在哺乳動(dòng)物中,mTLR8、 mTLR9、mDAI、mAIM2和mLRRFIP1基因分別與各物種的親緣關(guān)系密切,在進(jìn)化上比較保守。這說(shuō)明克隆的這些基因均具有模式識(shí)別受體的分子結(jié)構(gòu)特征。3.成功克隆了多種天然免疫信號(hào)通路效應(yīng)分子啟動(dòng)子元件序列,構(gòu)建了其表達(dá)報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)。應(yīng)用PCR技術(shù)從小鼠基因組中克隆了小鼠IFN-α2、IFN-α4, IFN-β和TNF-α啟動(dòng)子序列,測(cè)序結(jié)果表明所擴(kuò)增啟動(dòng)子序列正確；隨后將這些啟動(dòng)子元件序列構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL-4.10,測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了pGL-4.10-IFN-α2、pGL-4.10-IFN-α4、pGL-4.10-IFN-β、 pGL-4.10-TNF-α熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。同時(shí),也成功構(gòu)建了克隆的5種DNA識(shí)別受體的表達(dá)質(zhì)粒,并驗(yàn)證了其信號(hào)通路報(bào)告系統(tǒng),這為小鼠PRRs的天然免疫模式識(shí)別功能監(jiān)測(cè)研究提供了材料和平臺(tái)。4.成功分析了：mTLR8的組織差異表達(dá)特征,初步探討了其模式識(shí)別功能。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)分析了mTLR8的組織表達(dá)差異,結(jié)果顯示mTLR8在小鼠外周血、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸和肌肉中均有表達(dá),但表達(dá)量存在差異,其中在肺臟、脾臟和心臟中表達(dá)量較高。nTLR8的模式識(shí)別功能研究顯示,mTLR8的過(guò)表達(dá)可以啟動(dòng)NF-κB轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)TNF-α的分泌。但mTLR8不能識(shí)別R848與poly(dT)的復(fù)合物以及富含A/T的DNA序列。這說(shuō)明小鼠TLR8具有分子結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄表達(dá)和功能上的特殊性。5.成功分析了小鼠3種胞質(zhì)DNA識(shí)別受體的功能,為DNA受體的信號(hào)通路的深入研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。利用已建立的天然免疫信號(hào)通路報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng),分別對(duì)mDAI、mAIM2和mLRRFIP1的模式識(shí)別功能進(jìn)行研究,結(jié)果顯示mDAI、mAIM2和mLRRFIPI分別能夠識(shí)別富含A/T或C/G的DNA,并通過(guò)激活相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生,說(shuō)明這3種模式識(shí)別受體可能在小鼠抗DNA病毒感染的天然免疫中發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:澶╃劧鍏嶇柅鏄涓繪姷寰＄梾鍘熸劅鏌撶殑絎竴閬撻槻綰，

本文編號(hào)：1835603