本文選題：雞傳染性貧血病毒 + 感染性克隆　； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)在世界主要養(yǎng)禽國家廣泛分布,是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原體之一。雞是CIAV自然感染的唯一宿主,貧血、淋巴器官萎縮和免疫抑制等是CIAV引起的主要病變,常并發(fā)或繼發(fā)其它病原體,造成經(jīng)濟損失。本研究首先從安徽省某養(yǎng)殖場分離鑒定一株CIAV,并在克隆該株病毒全基因組的基礎(chǔ)上構(gòu)建感染性克隆,表達其毒力因子凋亡素(Apoptin),為進一步研究CIAV致病機理和疫苗設(shè)計提供參考。首先,提取安徽某雞場送檢病雞骨髓中DNA,通過自行設(shè)計的3對特異性引物以PCR方法分別擴增病毒3個基因,與pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌,對陽性克隆進行測序檢測。結(jié)果表明,病雞感染了CIAV,將該毒株命名為CIAV-HF211株。通過對CIAV-HF211株與國內(nèi)外8個分離株的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因進行同源進化分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因序列同源性為95%-99.1%,氨基酸序列同源性為96.7%-99.6%,其中與天津分離株AY846844同源性最高。其次,通過設(shè)計1對引物(引入EcoR I和Xhol I),擴增出CIAV-HF211株全基因組插入到真核表達載體pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建單拷貝pcD-CIAV。在此基礎(chǔ)上,通過另外1對引物擴增第二個全基因組序列并插入到病毒基因組自身攜帶的BamH I酶切位點處,構(gòu)建2個CIAV基因組順次連入一個載體的克隆,命名為pcD-2CIAV。通過腿肌注射1日齡SPF雞pcD-2CIAV重組質(zhì)粒(150μg/只),對照組分別注射PBS和病料研磨液,每組注射3-4只。在攻毒后第12d剖檢,觀察病變并進行病毒基因的檢測。結(jié)果表明,與PBS對照組相比,pcD-2CIAV重組質(zhì)粒與CIAV病料感染具有相似的病理變化,且PCR檢測結(jié)果為陽性,表明了成功構(gòu)建了1個CIAV感染性克隆。該結(jié)果為進一步研究CIAV-HF211株的致病性及研制疫苗奠定了基礎(chǔ)。最后,亞克隆CIAV-HF211分離株Apoptin基因,插入原核表達載體pET-32a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3),對陽性菌株經(jīng)0.2~1.0 mmol/L的IPTG誘導不同時間后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測,并通過鎳柱親和層析純化His-apoptin融合蛋白,免疫家兔,建立間接ELISA檢測Apoptin融合蛋白的抗體水平。以Western blot方法分析融合蛋白反應(yīng)原性。結(jié)果表明,經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導18h后可獲得較多可溶性表達的apoptin融合蛋白,分子量約為31.6kDa。第三次免疫后,Apoptin融合蛋白的抗血清效價達到1:1280000。Western blot分析表明,該抗血清可與融合蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。綜上所述,本研究分離鑒定了來自安徽區(qū)域的1株CIAV,并成功構(gòu)建了該株病毒的感染性克隆,對其Apoptin基因進行了原核表達,建立了間接ELISA方法檢測抗Apoptin抗體方法,為進一步研究CIAV致病機理和疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Chicken anemia virus (CIAV) is widely distributed in the world and is one of the main pathogens that harm poultry industry. Chicken is the only host of CIAV infection, anemia, lymphoid organ atrophy and immunosuppression are the main pathological changes caused by CIAV, often complicated or secondary to other pathogens, resulting in economic losses. In this study, a strain of CIAV was isolated and identified from a breeding farm in Anhui Province, and an infectious clone was constructed on the basis of cloning the whole genome of the virus, expressing its virulence factor, apoptin, which provides a reference for further study on the pathogenic mechanism of CIAV and the design of vaccine. Firstly, the DNA was extracted from bone marrow of infected chicken in a chicken farm in Anhui province. Three genes of the virus were amplified by PCR method and transformed into Escherichia coli by pMD18-T vector. The positive clones were sequenced. The results showed that the infected chicken was infected with CIAV, and the virus strain was named CIAV-HF211 strain. By homologous evolution analysis of VP1 gene of key structural protein of CIAV-HF211 strain and 8 strains at home and abroad, it was found that the homology of VP1 gene sequence was 95-99.1, the homology of amino acid sequence was 96.7- 99.6um, and the homology was the highest with Tianjin isolate AY846844. Secondly, the whole genome of CIAV-HF211 strain was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.1 () by designing a pair of primers (EcoR I and Xhol I), and a single copy pcD-CIAV was constructed. On this basis, the second whole genome sequence was amplified by another pair of primers and inserted into the BamH I site carried by the virus genome itself, and two CIAV genomes were sequentially cloned into a vector named pcD-2CIAV. The pcD-2CIAV recombinant plasmid of 1-day-old SPF chicken was injected intramuscularly into the leg, and the control group was injected with PBS and the grinding fluid of diseased materials respectively, 3 to 4 in each group. The lesion was observed and virus gene was detected 12 days after attack. The results showed that the recombinant plasmid pcD-2CIAV had similar pathological changes with CIAV infection compared with PBS control group, and PCR was positive, indicating the successful construction of a CIAV infectious clone. The results laid a foundation for further study on the pathogenicity of CIAV-HF211 strain and the development of vaccine. Finally, the Apoptin gene of CIAV-HF211 isolate was subcloned and inserted into the prokaryotic expression vector pET-32a (), and transformed into E. coli Rosetta-DE3N. The positive strain was induced by 0.21 mmol/L IPTG for different time and then detected by SDS-PAGE electrophoresis. The fusion protein of His-apoptin was purified by nickel column affinity chromatography. To immunize rabbits, indirect ELISA was established to detect the antibody level of Apoptin fusion protein. The reactivity of fusion protein was analyzed by Western blot. The results showed that more soluble apoptin fusion protein could be obtained after 1. 0 mmol/L IPTG induction for 18 h. The molecular weight of the fusion protein was about 31.6 kDa. After the third immunization, the antiserum titer of Apoptin fusion protein reached the level of 1:1280000.Western blot. The results showed that the antiserum could react specifically with the fusion protein. To sum up, a strain of CIAV from Anhui region was isolated and identified, and its infectious clone was successfully constructed, its Apoptin gene was expressed in prokaryotic expression, and indirect ELISA method was established for detection of anti Apoptin antibody. It lays a foundation for further study on the pathogenesis of CIAV and the development of vaccine.
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：1821697