本文選題：豬細(xì)小病毒 + 同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)��； 參考：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究目的：本研究主要運(yùn)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ)和相關(guān)分子生物學(xué)方法,以期篩選并獲得PPV感染后引起細(xì)胞病變和功能變化的關(guān)鍵蛋白,同時也為研究PPV引起母豬繁殖障礙的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ),并為研究病毒性疾病引起的家畜繁殖障礙研究提供新的思路。材料與方法：本實驗采用PCR技術(shù)和間接免疫熒光檢測PPV感染豬睪丸細(xì)胞(ST)后12 h,24 h,36 h,48 h和60 h時間段PPV VP2的表達(dá)量,確定病毒在感染細(xì)胞后病毒最佳表達(dá)時間點。在這個時間點收集感染和未感染細(xì)胞的蛋白,采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-ESI-MS/MS分析技術(shù)檢測感染組與未感染組之間蛋白表達(dá)差異。進(jìn)一步運(yùn)用生物信息學(xué)分析,從相關(guān)差異蛋白參與的生物學(xué)過程、其細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分和分子功能分析差異蛋白的功能,并構(gòu)建差異蛋白間相互作用網(wǎng),獲得參與PPV感染的重要蛋白。另外,分別采用實時熒光定量技術(shù)和免疫印跡驗證了部分差異蛋白對應(yīng)的基因水平和蛋白水,其中包括5個上調(diào)蛋白和4個下調(diào)蛋白。研究結(jié)果：PPV在感染ST細(xì)胞后在60 h檢測到其VP2核酸有較高表達(dá)量；通過iTRAQ結(jié)合LC-ESI-MS/MS技術(shù)共獲得27608個肽段,共計5002個蛋白；依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平變化(定義差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上為差異蛋白)共獲得218個差異蛋白,其中130個為感染后下調(diào)的蛋白,88個為感染后上調(diào)的蛋白；這些差異蛋白主要與細(xì)胞的周期、生長、運(yùn)動和能量代謝、細(xì)胞的骨架、胞內(nèi)的內(nèi)分泌以及轉(zhuǎn)錄翻譯等密切相關(guān)；熒光定量和免疫印跡對差異蛋白的驗證結(jié)果基本與iTRAQ的變化趨勢一致。結(jié)論：通過本研究得到了PPV感染ST細(xì)胞的蛋白圖譜及其差異表達(dá)蛋白,構(gòu)建了蛋白作用網(wǎng)絡(luò),并獲取了PPV感染ST細(xì)胞后的一些關(guān)鍵蛋白,但對于這些蛋白在PPV感染中的作用還需進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:Objective: in this study, the relative and absolute quantitative techniques of isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation, iTRAQ) and related molecular biology were used to screen and obtain the key proteins which caused cytopathic and functional changes after PPV infection. At the same time, it lays a foundation for the study of the pathogenic mechanism of reproductive disorders in sows caused by PPV, and provides a new idea for the study of reproductive disorders in domestic animals caused by viral diseases. Materials and methods: in this experiment, PCR technique and indirect immunofluorescence were used to detect the expression of PPV VP2 at 12 h, 24 h, 36 h, 48 h and 60 h after PPV infection in porcine testicular cells, and the optimal time point for virus expression was determined. The proteins of infected and uninfected cells were collected at this time point, and the difference of protein expression between infected and uninfected cells was detected by iTRAQ and LC-ESI-MS/MS analysis. Further more, bioinformatics was used to analyze the function of differential protein from the biological process, cell structure and molecular function, and to construct the interaction network of differential protein. To obtain the important protein involved in PPV infection. In addition, the gene level and protein water of partial differential proteins were verified by real-time fluorescence quantitative technique and Western blotting, including 5 up-regulated proteins and 4 down-regulated proteins. Results the VP2 nucleic acid of VP2 was detected at 60 h after infection of St cells, 27608 peptides were obtained by iTRAQ combined with LC-ESI-MS/MS technique, a total of 5002 proteins were obtained. A total of 218 proteins were obtained according to the changes of protein abundance (defined as differential proteins by more than 1.2 times), of which 130 were down-regulated after infection and 88 were up-regulated after infection. These differential proteins are mainly related to cell cycle, growth, movement and energy metabolism, cytoskeleton, intracellular endocrine and transcriptional translation. The results of fluorescent quantitative analysis and Western blotting were consistent with the trend of iTRAQ. Conclusion: the protein map and differentially expressed proteins of PPV infected St cells were obtained, and the protein action network was constructed, and some key proteins of PPV infected St cells were obtained. However, the role of these proteins in PPV infection needs further study.
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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本文編號：1820768