本文選題：柔嫩艾美耳球蟲 + 地克珠利�。� 參考：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2015年碩士論文

【摘要】：柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella,Et)是隸屬于頂器復(fù)合門(Apicomplexa)艾美耳屬的一種胞內(nèi)寄生性原蟲,可引起雞急性盲腸球蟲病,嚴(yán)重時可致雞只死亡。目前球蟲病的控制主要依賴抗球蟲藥物預(yù)防。地克珠利是一種三嗪類化合物,具有高效、低毒、廣譜的抗球蟲效力,但若長期使用或使用不當(dāng),會出現(xiàn)耐藥性。要防止或延緩耐藥性的發(fā)生,以及研制新的有效藥物,就必須了解該藥抗寄生蟲的分子作用機制,確定其靶標(biāo)分子。至今,關(guān)于地克珠利抗球蟲的分子作用機制還不清楚。乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)是糖酵解途徑的末端酶,能夠催化丙酮酸與乳酸之間可逆的氧化還原反應(yīng),大多數(shù)體內(nèi)寄生蟲依靠此途徑獲取能量維持生存。研究表明,E.tenella地克珠利敏感株LDH(s Et LDH)與耐藥株LDH(r Et LDH)的同工酶譜存在明顯差異,提示Et LDH與地克珠利抗球蟲作用機理存在一定聯(lián)系。本研究通過s Et LDH與r Et LDH特性的差異比較、地克珠利對E.tenella孢子生殖及裂殖生殖過程中LDH的影響研究,為揭示地克珠利的分子作用機理及尋找潛在的藥物靶標(biāo)奠定了重要基礎(chǔ)。1.Et LDH單克隆抗體的制備及其在蛋白定位中的應(yīng)用用大腸桿菌表達的重組Et LDH可溶性蛋白免疫BALB/c小鼠,經(jīng)5次免疫后取脾臟制備免疫脾細胞,與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合,用間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞,經(jīng)3次亞克隆后獲得2株能穩(wěn)定分泌Et LDH單克隆抗體的雜交瘤細胞株2F7和2H4,抗體亞類鑒定均為Ig G1,腹水效價分別為1:8 000和1:64 000。Western blot檢測顯示2F7單抗能識別E.tenella第二代裂殖子中大小約為35 KDa的天然蛋白,利用該單抗對Et LDH在E.tenella第二代裂殖子中的分布進行定位,結(jié)果顯示Et LDH主要分布于裂殖子的細胞質(zhì)。研究表明成功制備了Et LDH單克隆抗體,為深入研究Et LDH的功能和特性奠定了基礎(chǔ)。2.柔嫩艾美耳球蟲地克珠利敏感株與耐藥株LDH特性的差異研究克隆r Et LDH蛋白編碼區(qū)(Coding sequence,CDS),經(jīng)測序和生物信息學(xué)分析,r Et LDH CDS為996 bp,編碼331個氨基酸,與s Et LDH僅在第914位有1個堿基的差異,編碼蛋白僅在第305位有1個氨基酸的差異;熒光定量PCR結(jié)果顯示,在球蟲4個不同發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)中,r Et LDH m RNA的相對含量在子孢子階段最高,且每個階段中s Et LDH m RNA的相對含量都明顯高于相應(yīng)的r Et LDH(P0.01);Western blot結(jié)果表明,r Et LDH蛋白在第二代裂殖子階段的相對表達量比s Et LDH下降了55.32%(P0.01);建立了Et LDH催化反應(yīng)體系,正、逆反應(yīng)的最適溫度分別是50℃、40℃,最適p H分別為6.00、7.00,r Et LDH在孢子化卵囊的催化活力是s Et LDH的78.66%(P0.01)。結(jié)果表明,長期的藥物誘導(dǎo)使Et LDH的特性發(fā)生了改變,地克珠利的作用機理可能與LDH參與的糖酵解途徑有關(guān)。3.地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲孢子生殖過程LDH的影響研究將純化的未孢子化卵囊平均分成兩組,藥物組用1×10-6地克珠利溶液懸浮后4℃孵育12 h,對照組用等體積溶劑做相同處理。離心洗滌后,各組卵囊進行孢子化培養(yǎng)72 h。孢子化實驗結(jié)果顯示藥物組卵囊的孢子化率為對照組的66.32%(P0.01);酶活力測定結(jié)果顯示藥物組Et LDH氧化反應(yīng)催化活力為對照組的44.39%(P0.01),而還原反應(yīng)催化活力為對照組的115.76%(P0.01);熒光定量PCR結(jié)果顯示藥物組Et LDH基因的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的59.18%(P0.01);Western blot結(jié)果顯示藥物組Et LDH蛋白的翻譯水平為對照組的80.39%(P0.05)。推測地克珠利通過抑制糖酵解途徑中LDH的基因表達及酶活力來抑制球蟲的孢子生殖。4.地克珠利對柔嫩艾美耳球蟲裂殖生殖過程LDH的影響研究將新鮮的孢子化卵囊接種2周齡無球蟲雞,并分為藥物組和對照組。接種后第4 d,藥物組按1 mg/kg體重的劑量嗉囊灌服地克珠利溶液,對照組嗉囊灌服相同劑量的藥物溶劑,繼續(xù)正常飲水采食。收集純化第二代裂殖子,酶活力測定結(jié)果顯示藥物組Et LDH氧化反應(yīng)催化活力為對照組的37.66%(P0.01),而還原反應(yīng)催化活力為對照組的52.01%(P0.05);熒光定量PCR結(jié)果顯示藥物組Et LDH基因的轉(zhuǎn)錄水平為對照組的21.15%(P0.01);Western blot結(jié)果顯示藥物組Et LDH蛋白的翻譯水平為對照組的42.27%(P0.01);間接免疫熒光實驗顯示藥物使Et LDH在細胞質(zhì)中的分布范圍縮小。推測Et LDH是地克珠利的一種潛在藥物靶標(biāo)。
[Abstract]:In order to prevent or delay the occurrence of drug resistance and to develop new effective drugs , it is necessary to understand the molecular mechanism of the anti - parasite of E . tenella and to find potential drug targets . The results showed that the relative content of r Et LDH m RNA was higher than that of the corresponding r Et LDH ( P0.01 ) . The results showed that the relative content of r Et LDH m RNA was higher than that of the corresponding r Et LDH ( P0.01 ) . The results showed that the relative expression of the r Et LDH protein in the second generation merozoite stage was higher than that of the corresponding r Et LDH ( P0.01 ) . The results of Western blot showed that the activity of Et LDH in the drug group was 42.27 % in the control group ( P0.01 ) . The results of Western blot showed that the activity of Et LDH in the drug group was 42.27 % in the control group ( P0.01 ) . The results of Western blot showed that the activity of Et LDH in the drug group was 42.27 % in the control group ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：1812473