本文選題：單核細(xì)胞增多性李斯特菌 + 溶血素LLO　； 參考：《浙江農(nóng)林大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),簡(jiǎn)稱單增李斯特菌,是一種革蘭氏陽(yáng)性、食源性胞內(nèi)病原菌。LM主要通過(guò)分選酶(Sortase)系統(tǒng)將含有LPXTG基序的蛋白錨定至胞壁并發(fā)揮相應(yīng)功能。溶血素Listeriolysin O(LLO)是屬于依賴于膽固醇的膜穿孔蛋白家族(CDCs),在游離狀態(tài)下可以形成直徑35 nm的孔狀結(jié)構(gòu),插入到宿主細(xì)胞膜內(nèi),在李斯特菌逃離到細(xì)胞質(zhì)中扮演著重要的角色。本研究分別以單增李斯特菌參考菌株EGD-e和弱毒株M7溶血素蛋白(Listeriolysin O,LLO)為研究對(duì)象,通過(guò)同源重組及氨基酸突變技術(shù)將編碼LLO蛋白的基因hly在基因組水平上進(jìn)行如下修飾:(1)構(gòu)建LLO缺失突變株(ΔLLO);(2)將野生株LLO蛋白第472-483位氨基酸缺失,使其形成攜帶LPXTG基序的重組LLO菌株(LLOLPXTG)。Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示EGD-e和M7菌株缺失LLO后均未檢測(cè)到LLO蛋白的表達(dá),而LLOLPXTG缺失株檢測(cè)到重組LLO蛋白的表達(dá),證實(shí)ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株均構(gòu)建成功;鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7胞內(nèi)增殖試驗(yàn)表明,EGD-e的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的胞內(nèi)增殖力顯著減弱;溶血試驗(yàn)表明,M7的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的溶血活性完全喪失。體外原核表達(dá)純化LLO及其第472-483位氨基酸突變體蛋白,并研究其體外溶血活性。結(jié)果顯示只有LLO第478和479位氨基酸影響LLO的溶血活性。體內(nèi)外試驗(yàn)表明單增李斯特菌LLO蛋白與細(xì)菌感染宿主細(xì)胞后的增殖能力密切相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)LLO第472-483位氨基酸為其關(guān)鍵位點(diǎn),決定了LLO的活性及功能。LLO缺失株的構(gòu)建可以為細(xì)菌體內(nèi)表面展示技術(shù)在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行抗原展示和遞呈的研究奠定重要基礎(chǔ)。綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)單增李斯特菌LLO第472-483位氨基酸為其關(guān)鍵位點(diǎn)或功能域,決定了LLO的活性及功能;單增李斯特菌LLOLPXTG表面展示重組菌株為將來(lái)胞內(nèi)菌的抗原展示技術(shù)開發(fā)提供了一種工具,可用于病毒病的預(yù)防和治療。
[Abstract]:Listeria monocytogenes monocytogenes monocytogenes (Listeria monocytogenesus) is a Gram-positive bacteria. The protein-containing LPXTG motifs are anchored to the cell wall and play a corresponding function by the food-borne intracellular pathogen. Hemolysin (Listeriolysin) is a cholesterol dependent membrane perforated protein family, which can form a 35 nm diameter pore structure in the free state and insert into the host cell membrane, which plays an important role in the escape of Listeria to the cytoplasm. In this study, the reference strain of Listeria monocytogenes EGD-e and the attenuated strain M7 hemolysin Olol were studied. By homologous recombination and amino acid mutation technique, the gene hly encoding LLO protein was modified as follows at genomic level to construct LLO deletion mutant (螖 Llosian2), which deleted the 472-483 amino acid of LLO protein of wild strain. The expression of LLO protein was not detected in the EGD-e and M7 strains without LLO, while the expression of the recombinant LLO protein was detected in the LLOLPXTG deletion strain. It was confirmed that both 螖 LLO deletion and LLOLPXTG deletion were successfully constructed, and the intracellular proliferation of murine macrophage macrophage RAW264.7 was significantly decreased by RAW264.7 deletion of EGD-e and LLOLPXTG deletion. Hemolysis test showed that the hemolytic activity of 螖 LLO deletion strain and LLOLPXTG deletion strain of M7 was completely lost. LLO and its 472-483 amino acid mutant protein were expressed and purified in vitro and their hemolytic activity was studied. The results showed that only the 478th and 479-amino acids of LLO affected the hemolytic activity of LLO. In vitro and in vivo tests showed that the LLO protein of Listeria monocytogenes was closely related to the proliferation of host cells. In this study, we first found and confirmed that the 472-483 amino acid of LLO is the key site. It is determined that the activity and function of LLO. The construction of LLO deletion strain can lay an important foundation for the study of antigen display and presentation in host cells by the technique of bacterial surface display in vivo. To sum up, the amino acid at position 472-483 of Listeria monocytogenes LLO is the key site or functional domain, which determines the activity and function of LLO. The recombinant strain of Listeria monocytogenes LLOLPXTG surface display provides a tool for the development of antigen display technology of intracellular bacteria in the future and can be used in the prevention and treatment of virus diseases.
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：1800039