發(fā)布時(shí)間：2018-04-20 06:25

  本文選題：綿羊 + 白介素1β�。� 參考：《吉林大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：白介素1β（interleukin1β，IL-1β）和白介素1受體拮抗因子（interleukin1receptor antagonist，IL-1Ra）是白介素1（interleukin1，IL-1）家族的主要成員。IL-1β能夠協(xié)同其它細(xì)胞因子刺激T、B淋巴細(xì)胞活化并促進(jìn)多種炎性物質(zhì)合成。IL-1Ra與IL-1β三維結(jié)構(gòu)相似，能夠與IL-1Ra競爭細(xì)胞膜表面的I型白介素1受體（interleukin1receptor I，IL-1RI）。但是IL-1Ra與IL-1RI結(jié)合并不激發(fā)相關(guān)信號(hào)，從而能夠拮抗IL-1β的生物學(xué)功能。IL-1在宿主抵抗病原微生物入侵的過程中起到重要作用，但是IL-1β的過量表達(dá)會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)及自身免疫疾病。因此，IL-1β和IL-1Ra的平衡對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和預(yù)防疾病具有重要意義。研究表明，許多疾病可以引起IL-1β和IL-1Ra特異性的差異表達(dá)。通過分析IL-1β和IL-1Ra在疾病中的差異表達(dá)模式有望為相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療工作提供新的思路。 布魯氏菌病(brucellosis)簡稱“布病”是由布魯氏菌引起的人畜共患病，其臨床特點(diǎn)為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。快捷、可靠的血清學(xué)診斷方法，已被廣泛用于家畜布魯氏菌病的檢疫，如虎紅平板凝集試驗(yàn)。接種布魯氏菌減毒疫苗是預(yù)防布魯氏菌病的有效措施，但是布魯氏菌強(qiáng)毒株感染和疫苗免疫都能造成家畜血清學(xué)試驗(yàn)陽性。目前，缺乏有效的措施進(jìn)一步鑒別血清學(xué)試驗(yàn)陽性家畜的感染來源，導(dǎo)致無法區(qū)別診斷疫苗免疫家畜和布病患病動(dòng)物，給布病有效凈化帶來非常大的困難。本課題組前期工作通過構(gòu)建布魯氏菌強(qiáng)毒、弱毒株S2感染綿羊白細(xì)胞層抑制性消減雜交（SSH）cDNA文庫，篩選到差異表達(dá)基因IL-1β和IL-1Ra，推測IL-1β和IL-1Ra可能在綿羊感染布魯氏菌強(qiáng)毒或S2弱毒株過程中存在特異性的差異表達(dá)模式。通過揭示這種差異表達(dá)模式有望為鑒別血清學(xué)虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性家畜的感染來源提供科學(xué)依據(jù)。 1.綿羊IL-1β和IL-1Ra全長cDNA克隆、表達(dá)及分子特性分析 本研究以本課題組構(gòu)建的布魯氏菌強(qiáng)毒、S2弱毒株感染綿羊白細(xì)胞層SSH文庫中獲得的IL-1β和IL-1Ra部分基因序列為基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)，克隆獲得綿羊IL-1β和IL-1Ra的全長cDNA序列，其中IL-1β全長1494bp，開放閱讀框801bp，編碼266個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測綿羊IL-1β蛋白分子量為30.6kDa；IL-1Ra全長1228bp，，開放閱讀框525bp，編碼174個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測綿羊IL-1Ra蛋白分子量為19.8kDa。成功構(gòu)建綿羊IL-1β及IL-1Ra的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-IL-1β和pET-28a-IL-1Ra。通過誘導(dǎo)表達(dá)和親合層析純化技術(shù)獲得重組表達(dá)蛋白o(hù)rIL-1β及orIL-1Ra。通過生物信息學(xué)軟件及相關(guān)網(wǎng)站預(yù)測分析綿羊IL-1β及IL-1Ra核酸與蛋白的分子特性，以及通過胸腺細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)orIL-1β的生物學(xué)活性，進(jìn)而通過測定orIL-1Ra對(duì)IL-1β殺傷鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16的拮抗作用，證實(shí)orIL-1Ra的生物學(xué)活性。 2.抗綿羊IL-1β和IL-1Ra單克隆抗體的制備 分別應(yīng)用orIL-1β和orIL-1Ra免疫小鼠。通過細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，通過間接ELISA和Western Blot（WB）篩選分泌抗綿羊IL-1β抗體的雜交瘤細(xì)胞和分泌抗綿羊IL-1Ra抗體的雜交瘤細(xì)胞。抗體亞類鑒定2株雜交瘤細(xì)胞株所分泌抗體亞類均為IgG1。通過誘生腹水和G蛋白親合層析系統(tǒng)分別批量純化抗綿羊IL-1β和IL-1Ra的2種單克隆抗體。 3.綿羊IL-1β和IL-1Ra時(shí)空差異表達(dá)特性分析 利用本研究制備的單克隆抗體和WB技術(shù)，分析正常綿羊不同組織器官中IL-1β及IL-1Ra蛋白的組織特異性表達(dá)特性。發(fā)現(xiàn)IL-1β在正常綿羊的脾臟中含量最高，在白細(xì)胞中含量最低；IL-1Ra在正常綿羊肌肉中含量最高，而在肺臟中含量最低。 通過大腸桿菌、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（李氏桿菌）、沙門氏菌、布魯氏菌S2弱毒株和滅活布魯氏菌弱毒株S2菌體侵染綿羊原代外周血白細(xì)胞，對(duì)侵染后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-1Ra的含量進(jìn)行測定。大腸桿菌、李氏桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌弱毒株S2侵染綿羊外周血白細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β及IL-1Ra的含量均逐漸上升。滅活布魯氏菌弱毒株S2組白細(xì)胞培養(yǎng)上清液中2種細(xì)胞因子的相對(duì)含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。 利用熒光定量PCR技術(shù)分析布魯氏菌強(qiáng)毒和弱毒株S2感染綿羊后IL-1β及IL-1Ra基因在外周血白細(xì)胞層中轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)模式。IL-1β基因在強(qiáng)毒組和弱毒組白細(xì)胞層中的表達(dá)均呈先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)趨勢，強(qiáng)毒組在感染第14天時(shí)表達(dá)量最低，感染40天時(shí)表達(dá)量最高。在弱毒組感染7天時(shí)表達(dá)量最低，感染21天時(shí)表達(dá)量最高。IL-1Ra基因在強(qiáng)毒組和弱毒組中的表達(dá)都呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)的趨勢。應(yīng)用WB技術(shù)分析布魯氏菌強(qiáng)毒和弱毒株S2感染綿羊后IL-1β及IL-1Ra在血漿中的含量變化。IL-1β在強(qiáng)毒組及弱毒組血漿中的含量均隨著感染時(shí)間的延長先升高后下降。強(qiáng)毒組IL-1β升高水平高于弱毒組。IL-1Ra在強(qiáng)毒組及弱毒組血漿中的含量均在感染后40天明顯升高，而且在強(qiáng)毒組升高的水平高于弱毒組。 本研究以綿羊IL-1β及IL-1Ra為研究對(duì)象，克隆其全長cDNA，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化基因工程重組蛋白，制備其單克隆抗體，分析IL-1β和IL-1Ra的分子特性及其在正常綿羊和細(xì)菌侵染狀態(tài)下時(shí)空差異表達(dá)模式，為深入研究布病感染與免疫區(qū)別診斷生物標(biāo)示分子提供科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:Interleukin - 1尾 ( IL - 1尾 ) and interleukin - 1 receptor antagonist ( IL - 1Ra ) are the main members of interleukin - 1 ( IL - 1 ) family . IL - 1Ra can cooperate with other cytokines to stimulate T and B lymphocytes to activate and promote the synthesis of various inflammatory substances . IL - 1Ra is similar to the three - dimensional structure of IL - 1尾and can compete with IL - 1Ra to compete with IL - 1Ra to compete with type I interleukin 1 receptor ( IL - 1RI ) on the surface of cell membrane . IL - 1尾 and IL - 1Ra play an important role in maintaining homeostasis and preventing diseases . Therefore , the expression pattern of IL - 1尾and IL - 1Ra is expected to provide a new idea for the prevention , diagnosis and treatment of related diseases .

The results of this study have been widely used in quarantine such as chronic fever , hyperhidrosis , arthralgia , hepatosplenostasis and so on . It has been widely used in quarantine of domestic animals , such as tiger red plate agglutination test .

1 . Cloning , Expression and Molecular Characterization of Full - length cDNA of IL - 1尾 and IL - 1Ra in Sheep

The full - length cDNA sequence of IL - 1尾 and IL - 1Ra in sheep white blood cell layer SSH library was obtained by RACE technique . The cDNA sequence of IL - 1尾 and IL - 1Ra was cloned by RACE . The length of IL - 1尾was 1494bp , the open reading frame was 801bp , and 266 amino acid residues were encoded .
The recombinant expression plasmid pET - 30a - IL - 1尾and pET - 28a - IL - 1Ra were successfully constructed .

2 . Preparation of Anti - sheep IL - 1尾 and IL - 1Ra Monoclonal Antibodies

The hybridoma cells secreting anti - sheep IL - 1尾antibody and hybridoma cells secreting anti - sheep IL - 1Ra antibodies were screened by indirect ELISA and Western Blot ( WB ) . Two monoclonal antibodies against sheep IL - 1尾 and IL - 1Ra were purified by indirect ELISA and Western Blot ( WB ) .

3 . Analysis of Temporal and Spatial Differential Expression of IL - 1尾 and IL - 1Ra in Sheep

The specific expression of IL - 1尾 and IL - 1Ra in different tissues and organs of normal sheep was analyzed by using the monoclonal antibody and WB technique prepared by the study . It was found that the content of IL - 1尾 in the spleen of normal sheep was the highest , and the lowest in white blood cells .
IL - 1Ra is the highest in normal sheep muscle , while the lowest in lung .

The levels of IL - 1尾 and IL - 1Ra in cultured supernatant of sheep were determined by means of E . coli , M . li , S . S . S . , S.typhimurium , S2 attenuated strain and inactivated brucella strain S2 . The levels of IL - 1尾 and IL - 1Ra in the supernatant of culture supernatant were gradually increased after infection .

The expression of IL - 1尾and IL - 1Ra in plasma of virulent and weakly virulent groups was lowest . The levels of IL - 1Ra and IL - 1Ra in plasma of virulent and attenuated groups were higher than those in the weak group . The levels of IL - 1Ra and IL - 1Ra in plasma of virulent and attenuated groups were higher than those in the group of weak toxin .

In order to study the molecular characteristics of IL - 1尾 and IL - 1Ra and the expression pattern of space - time difference in normal sheep and bacteria infection , the molecular characteristics of IL - 1尾 and IL - 1Ra and the expression pattern of space - time difference in normal sheep and bacteria were analyzed .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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1 任洪林;盧士英;周玉;李兆輝;柳增善;;布魯氏菌病的研究與防控進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年09期

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6 薛勇;;布氏桿菌病的防治[J];農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備;2014年07期

7 陳旭昕;錢桂生;;SIGIRR與TLRs信號(hào)通路[J];四川醫(yī)學(xué);2011年03期

8 劉中成;鄒民吉;王園園;王嘉璽;徐東剛;;IL-1ra-Fcε融合基因的克隆、表達(dá)及鑒定[J];生物工程學(xué)報(bào);2008年10期

9 張文華;江劍平;;白介素-1β在炎性痛中的作用及其機(jī)制[J];生命科學(xué);2010年03期

10 ;Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research[J];Neural Regeneration Research;2011年15期

本文編號(hào)：1776639