本文選題：綿羊 + 白介素1β　； 參考：《吉林大學》2015年碩士論文

【摘要】：白介素1β（interleukin1β，IL-1β）和白介素1受體拮抗因子（interleukin1receptor antagonist，IL-1Ra）是白介素1（interleukin1，IL-1）家族的主要成員。IL-1β能夠協(xié)同其它細胞因子刺激T、B淋巴細胞活化并促進多種炎性物質合成。IL-1Ra與IL-1β三維結構相似，能夠與IL-1Ra競爭細胞膜表面的I型白介素1受體（interleukin1receptor I，IL-1RI）。但是IL-1Ra與IL-1RI結合并不激發(fā)相關信號，從而能夠拮抗IL-1β的生物學功能。IL-1在宿主抵抗病原微生物入侵的過程中起到重要作用，但是IL-1β的過量表達會引起嚴重的炎癥反應及自身免疫疾病。因此，IL-1β和IL-1Ra的平衡對維持機體穩(wěn)態(tài)和預防疾病具有重要意義。研究表明，許多疾病可以引起IL-1β和IL-1Ra特異性的差異表達。通過分析IL-1β和IL-1Ra在疾病中的差異表達模式有望為相關疾病的預防、診斷和治療工作提供新的思路。 布魯氏菌病(brucellosis)簡稱“布病”是由布魯氏菌引起的人畜共患病，其臨床特點為長期發(fā)熱、多汗、關節(jié)痛及肝脾腫大等�？旖荨⒖煽康难鍖W診斷方法，已被廣泛用于家畜布魯氏菌病的檢疫，如虎紅平板凝集試驗。接種布魯氏菌減毒疫苗是預防布魯氏菌病的有效措施，但是布魯氏菌強毒株感染和疫苗免疫都能造成家畜血清學試驗陽性。目前，缺乏有效的措施進一步鑒別血清學試驗陽性家畜的感染來源，導致無法區(qū)別診斷疫苗免疫家畜和布病患病動物，給布病有效凈化帶來非常大的困難。本課題組前期工作通過構建布魯氏菌強毒、弱毒株S2感染綿羊白細胞層抑制性消減雜交（SSH）cDNA文庫，篩選到差異表達基因IL-1β和IL-1Ra，推測IL-1β和IL-1Ra可能在綿羊感染布魯氏菌強毒或S2弱毒株過程中存在特異性的差異表達模式。通過揭示這種差異表達模式有望為鑒別血清學虎紅平板凝集試驗陽性家畜的感染來源提供科學依據(jù)。 1.綿羊IL-1β和IL-1Ra全長cDNA克隆、表達及分子特性分析 本研究以本課題組構建的布魯氏菌強毒、S2弱毒株感染綿羊白細胞層SSH文庫中獲得的IL-1β和IL-1Ra部分基因序列為基礎，利用RACE技術，克隆獲得綿羊IL-1β和IL-1Ra的全長cDNA序列，其中IL-1β全長1494bp，開放閱讀框801bp，編碼266個氨基酸殘基，預測綿羊IL-1β蛋白分子量為30.6kDa；IL-1Ra全長1228bp，，開放閱讀框525bp，編碼174個氨基酸殘基，預測綿羊IL-1Ra蛋白分子量為19.8kDa。成功構建綿羊IL-1β及IL-1Ra的重組表達質粒pET-30a-IL-1β和pET-28a-IL-1Ra。通過誘導表達和親合層析純化技術獲得重組表達蛋白orIL-1β及orIL-1Ra。通過生物信息學軟件及相關網(wǎng)站預測分析綿羊IL-1β及IL-1Ra核酸與蛋白的分子特性，以及通過胸腺細胞增殖實驗證實orIL-1β的生物學活性，進而通過測定orIL-1Ra對IL-1β殺傷鼠黑色素瘤細胞株B16的拮抗作用，證實orIL-1Ra的生物學活性。 2.抗綿羊IL-1β和IL-1Ra單克隆抗體的制備 分別應用orIL-1β和orIL-1Ra免疫小鼠。通過細胞融合技術將小鼠B細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，通過間接ELISA和Western Blot（WB）篩選分泌抗綿羊IL-1β抗體的雜交瘤細胞和分泌抗綿羊IL-1Ra抗體的雜交瘤細胞�？贵w亞類鑒定2株雜交瘤細胞株所分泌抗體亞類均為IgG1。通過誘生腹水和G蛋白親合層析系統(tǒng)分別批量純化抗綿羊IL-1β和IL-1Ra的2種單克隆抗體。 3.綿羊IL-1β和IL-1Ra時空差異表達特性分析 利用本研究制備的單克隆抗體和WB技術，分析正常綿羊不同組織器官中IL-1β及IL-1Ra蛋白的組織特異性表達特性。發(fā)現(xiàn)IL-1β在正常綿羊的脾臟中含量最高，在白細胞中含量最低；IL-1Ra在正常綿羊肌肉中含量最高，而在肺臟中含量最低。 通過大腸桿菌、單核細胞增生性李斯特氏菌（李氏桿菌）、沙門氏菌、布魯氏菌S2弱毒株和滅活布魯氏菌弱毒株S2菌體侵染綿羊原代外周血白細胞，對侵染后不同時間點細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-1Ra的含量進行測定。大腸桿菌、李氏桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌弱毒株S2侵染綿羊外周血白細胞后細胞培養(yǎng)上清中IL-1β及IL-1Ra的含量均逐漸上升。滅活布魯氏菌弱毒株S2組白細胞培養(yǎng)上清液中2種細胞因子的相對含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。 利用熒光定量PCR技術分析布魯氏菌強毒和弱毒株S2感染綿羊后IL-1β及IL-1Ra基因在外周血白細胞層中轉錄水平的差異表達模式。IL-1β基因在強毒組和弱毒組白細胞層中的表達均呈先下調(diào)后上調(diào)的表達趨勢，強毒組在感染第14天時表達量最低，感染40天時表達量最高。在弱毒組感染7天時表達量最低，感染21天時表達量最高。IL-1Ra基因在強毒組和弱毒組中的表達都呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢。應用WB技術分析布魯氏菌強毒和弱毒株S2感染綿羊后IL-1β及IL-1Ra在血漿中的含量變化。IL-1β在強毒組及弱毒組血漿中的含量均隨著感染時間的延長先升高后下降。強毒組IL-1β升高水平高于弱毒組。IL-1Ra在強毒組及弱毒組血漿中的含量均在感染后40天明顯升高，而且在強毒組升高的水平高于弱毒組。 本研究以綿羊IL-1β及IL-1Ra為研究對象，克隆其全長cDNA，利用原核表達系統(tǒng)表達并純化基因工程重組蛋白，制備其單克隆抗體，分析IL-1β和IL-1Ra的分子特性及其在正常綿羊和細菌侵染狀態(tài)下時空差異表達模式，為深入研究布病感染與免疫區(qū)別診斷生物標示分子提供科學依據(jù)。
[Abstract]:Interleukin - 1尾 ( IL - 1尾 ) and interleukin - 1 receptor antagonist ( IL - 1Ra ) are the main members of interleukin - 1 ( IL - 1 ) family . IL - 1Ra can cooperate with other cytokines to stimulate T and B lymphocytes to activate and promote the synthesis of various inflammatory substances . IL - 1Ra is similar to the three - dimensional structure of IL - 1尾and can compete with IL - 1Ra to compete with IL - 1Ra to compete with type I interleukin 1 receptor ( IL - 1RI ) on the surface of cell membrane . IL - 1尾 and IL - 1Ra play an important role in maintaining homeostasis and preventing diseases . Therefore , the expression pattern of IL - 1尾and IL - 1Ra is expected to provide a new idea for the prevention , diagnosis and treatment of related diseases .

The results of this study have been widely used in quarantine such as chronic fever , hyperhidrosis , arthralgia , hepatosplenostasis and so on . It has been widely used in quarantine of domestic animals , such as tiger red plate agglutination test .

1 . Cloning , Expression and Molecular Characterization of Full - length cDNA of IL - 1尾 and IL - 1Ra in Sheep

The full - length cDNA sequence of IL - 1尾 and IL - 1Ra in sheep white blood cell layer SSH library was obtained by RACE technique . The cDNA sequence of IL - 1尾 and IL - 1Ra was cloned by RACE . The length of IL - 1尾was 1494bp , the open reading frame was 801bp , and 266 amino acid residues were encoded .
The recombinant expression plasmid pET - 30a - IL - 1尾and pET - 28a - IL - 1Ra were successfully constructed .

2 . Preparation of Anti - sheep IL - 1尾 and IL - 1Ra Monoclonal Antibodies

The hybridoma cells secreting anti - sheep IL - 1尾antibody and hybridoma cells secreting anti - sheep IL - 1Ra antibodies were screened by indirect ELISA and Western Blot ( WB ) . Two monoclonal antibodies against sheep IL - 1尾 and IL - 1Ra were purified by indirect ELISA and Western Blot ( WB ) .

3 . Analysis of Temporal and Spatial Differential Expression of IL - 1尾 and IL - 1Ra in Sheep

The specific expression of IL - 1尾 and IL - 1Ra in different tissues and organs of normal sheep was analyzed by using the monoclonal antibody and WB technique prepared by the study . It was found that the content of IL - 1尾 in the spleen of normal sheep was the highest , and the lowest in white blood cells .
IL - 1Ra is the highest in normal sheep muscle , while the lowest in lung .

The levels of IL - 1尾 and IL - 1Ra in cultured supernatant of sheep were determined by means of E . coli , M . li , S . S . S . , S.typhimurium , S2 attenuated strain and inactivated brucella strain S2 . The levels of IL - 1尾 and IL - 1Ra in the supernatant of culture supernatant were gradually increased after infection .

The expression of IL - 1尾and IL - 1Ra in plasma of virulent and weakly virulent groups was lowest . The levels of IL - 1Ra and IL - 1Ra in plasma of virulent and attenuated groups were higher than those in the weak group . The levels of IL - 1Ra and IL - 1Ra in plasma of virulent and attenuated groups were higher than those in the group of weak toxin .

In order to study the molecular characteristics of IL - 1尾 and IL - 1Ra and the expression pattern of space - time difference in normal sheep and bacteria infection , the molecular characteristics of IL - 1尾 and IL - 1Ra and the expression pattern of space - time difference in normal sheep and bacteria were analyzed .

【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻】

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本文編號：1776639