本文選題：北京鴨 + TLR3　； 參考：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:先天性免疫是機(jī)體感知并體抵抗病原的第一道防線(xiàn),Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是模式識(shí)別受體的重要組成部分,能夠感知病原體相關(guān)模式分子,啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答。目前關(guān)于鴨Toll樣受體3(Toll-like receptor 3,TLR3)的結(jié)構(gòu)及功能了解不多,本研究從克隆北京鴨TLR3基因出發(fā),利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)及功能,制備鴨TLR3多克隆抗體和建立TLR3熒光定量PCR方法,利用上述技術(shù)評(píng)估鴨內(nèi)源性TLR3抗病毒功能。方法:(1)采用RT-PCR技術(shù)從北京鴨外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆出北京鴨TLR3,命名為duTLR3。利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)及功能;(2)采用PCR方法擴(kuò)增鴨TLR3基因胞外區(qū),將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,IPTG誘導(dǎo),表達(dá)重組TLR3蛋白,并采用從包涵體中純化重組蛋白。PCR擴(kuò)增得到972 bp的TLR3基因胞外區(qū),用純化的重組TLR3蛋白免疫試驗(yàn)兔,制備TLR3的多克隆抗體,用Western blot和ELISA檢測(cè)其特異性及效價(jià);(3)根據(jù)鴨TLR3的基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物,以鴨β肌動(dòng)蛋白mRNA為內(nèi)參,建立一種檢測(cè)鴨Toll樣受體3 mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR方法;(4)采用上述已建立的方法在細(xì)胞和組織水平檢測(cè)TLR3的抗病毒功能。結(jié)果:(1)克隆了北京鴨TLR3基因,預(yù)測(cè)分析了duTLR3具有典型的TLR家族結(jié)構(gòu)特征;(2)成功表達(dá)了TLR3基因胞外區(qū),并制備了特異性良好的多克隆抗體;(3)定量檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在1×102~1×108 copies/μL范圍內(nèi),具有良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)和擴(kuò)增效率均在0.9以上。熔解曲線(xiàn)顯示,PCR產(chǎn)物為單峰,具有高度擴(kuò)增特異性。重復(fù)性結(jié)果表明,該方法組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于3%,最低檢測(cè)濃度達(dá)100copies/μL。TLR3在鴨組織器官中的表達(dá)和分布情況檢測(cè)結(jié)果表明,TLR3在鴨子的各種組織或器官中均有分布,其中以氣管的表達(dá)水平最高,而在脾臟的表達(dá)水平最低;(4)DEF和組織水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TLR3及其下游細(xì)胞因子表達(dá)與DRV(Duck reovirus)滴度呈正相關(guān)。結(jié)論:初步證實(shí)鴨TLR3與DRV存在相互作用,通過(guò)下游信號(hào)分子和抗病毒蛋白發(fā)揮其抗病毒功能。
[Abstract]:Aim: innate immunity is the first line of defense against pathogens, Toll-like receptor (TLRR) is an important part of pattern recognition receptor, which can sense pathogen-related model molecules and initiate innate immune response.At present, little is known about the structure and function of duck Toll like receptor 3(Toll-like receptor 3 (TLR3). Based on the cloning of TLR3 gene of Peking duck, this study used bioinformatics technology to predict its structure and function, to prepare duck TLR3 polyclonal antibody and to establish the method of TLR3 fluorescence quantitative PCR.To evaluate the antiviral function of duck endogenous TLR3 using the above technique.Methods TLR3 was cloned from the peripheral blood mononuclear cells of Beijing duck by RT-PCR technique and named duTLR3.The extracellular region of duck TLR3 gene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a (). The recombinant TLR3 protein was induced by the transformation of Escherichia coli BL21DE3 strain.The extracellular region of TLR3 gene was amplified by PCR and purified from inclusion body. The purified recombinant TLR3 protein was used to immunize rabbits to prepare the polyclonal antibody to TLR3.Western blot and ELISA were used to detect its specificity and titer. According to the conserved region of duck TLR3 gene sequence, specific primers were designed, and duck 尾 -actin mRNA was used as internal control.A fluorescent quantitative PCR method for detecting the expression of duck Toll like receptor 3 mRNA was established. The established method was used to detect the antiviral function of TLR3 at cell and tissue level.Results the TLR3 gene of Peking duck was cloned, and the characteristic of TLR family structure of duTLR3 was predicted. (2) the extracellular domain of TLR3 gene was successfully expressed.The standard curve of the method was in the range of 1 脳 10 ~ 2 and 1 脳 10 ~ 8 copies/ 渭 L, and the correlation coefficient and amplification efficiency were above 0.9.The melting curve showed that the PCR product was a single peak with high amplification specificity.The results of repeatability showed that the coefficient of variation between groups was less than 3, and the lowest detection concentration was 100copies/ 渭 L.TLR3 in duck tissues and organs. The results showed that TLR3 was distributed in all tissues and organs of ducks.The expression of TLR3 and its downstream cytokines were positively correlated with the titer of DRV(Duck reovirus.Conclusion: the interaction between duck TLR3 and DRV was preliminarily confirmed, and its antiviral function was played by downstream signal molecules and antiviral proteins.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S834.81

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本文編號(hào)：1756803