發(fā)布時(shí)間：2018-04-15 20:29

  本文選題：鴨病毒性肝炎 + GDD模體�。� 參考：《畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)》2017年03期

【摘要】：為篩選能抑制DHAV-1復(fù)制的siRNA,探索RNAi技術(shù)在鴨病毒性肝炎防治中的應(yīng)用,采用PCR法擴(kuò)增DHAV-1 RdRp基因,并構(gòu)建pEGFP-RdRp融合表達(dá)EGFP-RdRp蛋白;根據(jù)RdRp的序列測(cè)定結(jié)果,設(shè)計(jì)3條RdRp特異siRNA,并合成相應(yīng)shRNA分別插入pmiRZipΔ中構(gòu)建pRdRp-shRNA;共轉(zhuǎn)染pRdRp-shRNA和pEGFP-RdRp于HEK-293T細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡法、流式細(xì)胞術(shù)、相對(duì)熒光定量PCR法篩選抑制效率較高的siRNA;將高效siRNA用于病毒載體pmiRZip介導(dǎo)的慢病毒制備;通過(guò)計(jì)算重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、DHAV-1感染的鴨胚胎成纖維細(xì)胞中病毒TCID50和RdRp基因表達(dá)量確定siRNA對(duì)病毒及病毒基因的抑制作用。結(jié)果顯示,3個(gè)siRNA均能抑制RdRp基因的表達(dá),包含GDD模體的shRNA2的抑制率最高,對(duì)應(yīng)重組病毒能使DHAV-1的TCID50下降6.2lg,RdRp基因轉(zhuǎn)錄量下降89.6%,抑制時(shí)間至少達(dá)120h,為鴨病毒性肝炎臨床防治提供了新思路。
[Abstract]:In order to screen siRNAs that can inhibit DHAV-1 replication, and to explore the application of RNAi technology in the prevention and treatment of duck viral hepatitis, the DHAV-1 RdRp gene was amplified by PCR method, and pEGFP-RdRp fusion was constructed to express EGFP-RdRp protein.Three RdRp specific siRNAs were designed, and the corresponding shRNA was inserted into pmiRZip 螖 to construct pRdRp-shRNAs. PRdRp-shRNA and pEGFP-RdRp were co-transfected into HEK-293T cells.Relative fluorescence quantitative PCR was used to screen siRNAs with high inhibition efficiency, and efficient siRNA was used to prepare lentivirus mediated by viral vector pmiRZip.By calculating the expression of TCID50 and RdRp genes in DHAV-1 infected duck embryonic fibroblasts infected by recombinant lentivirus, the inhibitory effect of siRNA on virus and virus genes was determined.The results showed that all three siRNA could inhibit the expression of RdRp gene, and the shRNA2 containing GDD motifs had the highest inhibition rate.The corresponding recombinant virus can reduce the TCID50 of DHAV-1 by 89.6% of the transcription of RdRp gene and the inhibition time of 120h, which provides a new idea for clinical prevention and treatment of duck viral hepatitis.
【作者單位】： 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：2016年度江蘇省高校自然科學(xué)研究面上資助項(xiàng)目(16KJB230004) 江蘇省“六大人才高峰”第十二批培養(yǎng)對(duì)象資助項(xiàng)目(NY-023,10410015002) 江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃校企合作基金項(xiàng)目(201612806030H)
【分類號(hào)】：S852.65

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