本文選題：MHCI + 克隆��； 參考：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex class)是存在于脊椎動(dòng)物特定染色體上的具高度多態(tài)性的一組基因群,其編碼產(chǎn)物為免疫分子,可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分子。其中,雞Ⅰ類分子為B-F。α鏈具有高度多態(tài)性,主要由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,即信號(hào)肽、胞外區(qū)(α1、α2和α3)、跨膜區(qū)(TM)和胞漿區(qū)(Cyt)。在α1與α2區(qū)域內(nèi)存在肽結(jié)合區(qū)(PBR),它能與抗原短肽結(jié)合。由于MHC分子的多態(tài)性,導(dǎo)致了動(dòng)物機(jī)體對(duì)特定病原體抵抗力的不同,并影響生長(zhǎng)發(fā)育等經(jīng)濟(jì)性狀。雞不同品種在進(jìn)化中因分布于不同區(qū)域,受到不同環(huán)境因素包括疫病等壓力影響,形成了外形、生產(chǎn)性能等方面的較大差異。MHC分子在演變中也受到影響。在各類研究中,安徽地方品種淮南麻黃雞Mhc基因特性未有涉及。為此,本研究對(duì)淮南麻黃雞Mhc Ⅰ (B-F)進(jìn)行了分子克隆,研究了該分子的特征以揭示該品種的MHC分子進(jìn)化規(guī)律。首先,抽提淮南麻黃雞50羽個(gè)體的血細(xì)胞總RNA,之后擴(kuò)增cDNA,連接載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑陽(yáng)性克隆送測(cè)序鑒定。結(jié)果顯示,克隆到大小分別為1136bp的B-FA基因片段和396bp的B-FB基因片段,測(cè)序獲得了34條B-FA的cDNA序列和15條B-FB的cDNA序列。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析B-FA和B-FB基因結(jié)構(gòu)和多態(tài)性特征,結(jié)果表明,B-FA的ORF大小有兩種,一種大小為1068bp,另一種大小是1035bp,分別編碼356個(gè)氨基酸(aa)和345個(gè)aa。經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),兩者都含有信號(hào)肽(21aa)、α1(88aa)、α2(91aa)和α3(91aa),不同之處在TM/Cyt區(qū)域,是由于第7外顯子缺失。相比之下B-FB基因則比較保守。其次,構(gòu)建含B-F基因的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳表明,B-FA基因表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在為主,B-FB基因表達(dá)產(chǎn)物以可溶性蛋白的形式存在為主。它們的分子量分別為52.1kDa、33.0 kDa。用純化的蛋白免疫小鼠,獲得了鼠抗雞B-F多克隆抗體,并通過(guò)免疫印跡進(jìn)行了抗體的特異性檢測(cè),表明抗體能與目的蛋白特異性結(jié)合。最后,構(gòu)建含B-F基因的重組真核質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,隨后觀察瞬時(shí)表達(dá)特性,發(fā)現(xiàn)它們均能在細(xì)胞漿膜區(qū)表達(dá)定位。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究淮南麻黃雞分子進(jìn)化規(guī)律、B-F分子攜帶抗原肽的原理及后續(xù)基因疫苗的制備提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Major histocompatibility complex, a major histocompatibility complex, is a highly polymorphic group of genes found on specific chromosomes in vertebrates. Its coding products are immune molecules, which can be classified into 鈪，

本文編號(hào)：1747400