本文選題：日本血吸蟲 + Wnt2��； 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：日本血吸蟲(Schistosoma japonicum Katsurada)是一種分布廣泛人畜均可感染的寄生蟲,是危害人畜最為嚴(yán)重的寄生蟲之一。Wnt信號(hào)通路存在于多細(xì)胞生物體內(nèi),參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、胚胎發(fā)育、體軸的建立,調(diào)節(jié)著機(jī)體的生長(zhǎng)與發(fā)育。被分泌到胞外Wnt蛋白與相應(yīng)跨膜受體Frizzled相結(jié)合,激活下游靶基因進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。為了解Wnt家族基因在日本血吸蟲發(fā)育中的調(diào)節(jié),本研究對(duì)日本血吸蟲不同發(fā)育階段的Wnt家族基因m RNA進(jìn)行比較分析以及利用體內(nèi)、體外兩種方式對(duì)Sj Wnt2、Sj Wnt4靶基因進(jìn)行抑制,初步探究Wnt家族基因在蟲體發(fā)育中的作用。同時(shí),通過(guò)免疫熒光與Western blot技術(shù)對(duì)Wnt、Frizzled真核表達(dá)載體重組蛋白進(jìn)行鑒定分析,為下一步確定受配體識(shí)別關(guān)系建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.Wnt家族基因在不同發(fā)育階段蟲體及不同宿主來(lái)源的蟲體間m RNA水平比較分析通過(guò)熒光定量PCR比較了日本血吸蟲Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5、Wnt11在不同發(fā)育階段及不同性別中相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果顯示,在早期發(fā)育階段Sj Wnt1在7d處于最高的表達(dá)水平,Sj Wnt2在egg階段處于一個(gè)相對(duì)高的的水平,Sj Wnt4、Sj Wnt5在18天表達(dá)到達(dá)最高,Sj Wnt11在14天與18天這兩個(gè)階段中遠(yuǎn)高于egg階段,提示W(wǎng)nt家族基因功能與蟲卵發(fā)育到性成熟這一重要生理過(guò)程密切相關(guān)。通過(guò)熒光定量PCR分析了單復(fù)性感染不同宿主的雌雄血吸蟲Wnt家族基因m RNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:發(fā)育不正常的雌雄個(gè)體其Wnt基因表達(dá)含量高于正常的雌雄個(gè)體,推測(cè)Wnt信號(hào)通路過(guò)度表達(dá)可能會(huì)抑制血吸蟲的生長(zhǎng)、生殖器官的發(fā)育。單性感染的BALB/c小鼠單性雌蟲生殖器官處于發(fā)育不良的狀態(tài),且Wnt家族基因異常高表達(dá),可能會(huì)抑制其生殖器官的發(fā)育。2.日本血吸蟲Wnt2、Wnt4評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)Sj Wnt2 si RNA小分子進(jìn)行抑制效果評(píng)價(jià),同時(shí)對(duì)Wnt家族基因及下游部分基因進(jìn)行體外干擾的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示:篩選得到最佳抑制效果的si RNA編號(hào)為Sj Wnt2-615,對(duì)Wnt家族其它基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,其靶向性較好。同時(shí)對(duì)三條信號(hào)通路的7個(gè)關(guān)鍵分子分析m RNA表達(dá)水平,Sj Wnt2基因下調(diào)后對(duì)Wnt/β-catenin通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路有著不同程度的激活。通過(guò)體外Sj Wnt4 siRNA干擾,小分子在48h就可以達(dá)到很好的抑制效果。體內(nèi)不同期別干擾效果評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,14天、42天抑制效果較好且比較穩(wěn)定,對(duì)25天抑制效果有所下降,對(duì)雌蟲抑制效果略高于雄蟲。3.Wnt信號(hào)通路受配體的在293T細(xì)胞中表達(dá)利用熒光顯微鏡檢測(cè)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的Wnt、Frizzled質(zhì)粒,結(jié)果顯示在293T細(xì)胞中有表達(dá),在Wnt2、Wnt4與Frizzled5、Frizzled8共轉(zhuǎn)染組,顯示共轉(zhuǎn)染質(zhì)�？梢栽谕患�(xì)胞中共表達(dá)。通過(guò)Western blot鑒定蛋白分子量與理論分子量大小相一致。本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)定量方法來(lái)評(píng)價(jià)正常蟲體在發(fā)育的各階段中Wnt家族基因的m RNA水平,同時(shí)分析了單復(fù)性感染25d時(shí)其Wnt家族基因m RNA轉(zhuǎn)錄水平。篩選出抑制效果最好的Sj Wnt2 si RNA,并確定了最佳的濃度。同時(shí)對(duì)Wnt家族基因及下游基因干擾效果做出評(píng)價(jià)。對(duì)Sj Wnt4體內(nèi)外不同時(shí)間段的干擾效果進(jìn)行評(píng)價(jià),摸索出最佳的干擾條件。另外,對(duì)已構(gòu)建好的p3x FLAG-Wnts、p RK5-Frizzleds-myc受配體在293T細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行鑒定,為下一步對(duì)Wnt信號(hào)途徑在血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育的功能研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Wnt1 , Wnt2 , Wnt4 , Wnt5 , Wnt11 in different developmental stages of Schistosoma japonicum were analyzed by fluorescence quantitative PCR . Wnt2 , Wnt4 and Frizzled5 , Frizzled8 co - transfected groups were used to evaluate the mRNA levels of Wnt family genes .

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7

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本文編號(hào)：1739894