發(fā)布時間：2018-04-12 13:13

  本文選題：日本血吸蟲 + Wnt2�。� 參考：《吉林農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：日本血吸蟲(Schistosoma japonicum Katsurada)是一種分布廣泛人畜均可感染的寄生蟲,是危害人畜最為嚴重的寄生蟲之一。Wnt信號通路存在于多細胞生物體內(nèi),參與調(diào)節(jié)細胞的分化、胚胎發(fā)育、體軸的建立,調(diào)節(jié)著機體的生長與發(fā)育。被分泌到胞外Wnt蛋白與相應(yīng)跨膜受體Frizzled相結(jié)合,激活下游靶基因進而產(chǎn)生相應(yīng)生物學效應(yīng)。為了解Wnt家族基因在日本血吸蟲發(fā)育中的調(diào)節(jié),本研究對日本血吸蟲不同發(fā)育階段的Wnt家族基因m RNA進行比較分析以及利用體內(nèi)、體外兩種方式對Sj Wnt2、Sj Wnt4靶基因進行抑制,初步探究Wnt家族基因在蟲體發(fā)育中的作用。同時,通過免疫熒光與Western blot技術(shù)對Wnt、Frizzled真核表達載體重組蛋白進行鑒定分析,為下一步確定受配體識別關(guān)系建立實驗基礎(chǔ)。1.Wnt家族基因在不同發(fā)育階段蟲體及不同宿主來源的蟲體間m RNA水平比較分析通過熒光定量PCR比較了日本血吸蟲Wnt1、Wnt2、Wnt4、Wnt5、Wnt11在不同發(fā)育階段及不同性別中相對表達水平,結(jié)果顯示,在早期發(fā)育階段Sj Wnt1在7d處于最高的表達水平,Sj Wnt2在egg階段處于一個相對高的的水平,Sj Wnt4、Sj Wnt5在18天表達到達最高,Sj Wnt11在14天與18天這兩個階段中遠高于egg階段,提示W(wǎng)nt家族基因功能與蟲卵發(fā)育到性成熟這一重要生理過程密切相關(guān)。通過熒光定量PCR分析了單復(fù)性感染不同宿主的雌雄血吸蟲Wnt家族基因m RNA的表達水平。結(jié)果顯示:發(fā)育不正常的雌雄個體其Wnt基因表達含量高于正常的雌雄個體,推測Wnt信號通路過度表達可能會抑制血吸蟲的生長、生殖器官的發(fā)育。單性感染的BALB/c小鼠單性雌蟲生殖器官處于發(fā)育不良的狀態(tài),且Wnt家族基因異常高表達,可能會抑制其生殖器官的發(fā)育。2.日本血吸蟲Wnt2、Wnt4評價實時定量PCR對Sj Wnt2 si RNA小分子進行抑制效果評價,同時對Wnt家族基因及下游部分基因進行體外干擾的評價結(jié)果顯示:篩選得到最佳抑制效果的si RNA編號為Sj Wnt2-615,對Wnt家族其它基因表達水平進行分析,其靶向性較好。同時對三條信號通路的7個關(guān)鍵分子分析m RNA表達水平,Sj Wnt2基因下調(diào)后對Wnt/β-catenin通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路有著不同程度的激活。通過體外Sj Wnt4 siRNA干擾,小分子在48h就可以達到很好的抑制效果。體內(nèi)不同期別干擾效果評價結(jié)果顯示,14天、42天抑制效果較好且比較穩(wěn)定,對25天抑制效果有所下降,對雌蟲抑制效果略高于雄蟲。3.Wnt信號通路受配體的在293T細胞中表達利用熒光顯微鏡檢測脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的Wnt、Frizzled質(zhì)粒,結(jié)果顯示在293T細胞中有表達,在Wnt2、Wnt4與Frizzled5、Frizzled8共轉(zhuǎn)染組,顯示共轉(zhuǎn)染質(zhì)�？梢栽谕患毎泄脖磉_。通過Western blot鑒定蛋白分子量與理論分子量大小相一致。本研究運用實時定量方法來評價正常蟲體在發(fā)育的各階段中Wnt家族基因的m RNA水平,同時分析了單復(fù)性感染25d時其Wnt家族基因m RNA轉(zhuǎn)錄水平。篩選出抑制效果最好的Sj Wnt2 si RNA,并確定了最佳的濃度。同時對Wnt家族基因及下游基因干擾效果做出評價。對Sj Wnt4體內(nèi)外不同時間段的干擾效果進行評價,摸索出最佳的干擾條件。另外,對已構(gòu)建好的p3x FLAG-Wnts、p RK5-Frizzleds-myc受配體在293T細胞中表達進行鑒定,為下一步對Wnt信號途徑在血吸蟲生長發(fā)育的功能研究奠定實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:Wnt1 , Wnt2 , Wnt4 , Wnt5 , Wnt11 in different developmental stages of Schistosoma japonicum were analyzed by fluorescence quantitative PCR . Wnt2 , Wnt4 and Frizzled5 , Frizzled8 co - transfected groups were used to evaluate the mRNA levels of Wnt family genes .

【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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