本文選題：Toll樣受體 + 鴨Toll樣受體5��； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)是一類跨膜蛋白家族,通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。TLRs被認(rèn)為是最有特點(diǎn)的先天性受體,在宿主抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。不同的TLRs識(shí)別特定的分子標(biāo)志并且啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答,如TLR2和TLR3復(fù)合物或TLR2和TLR6復(fù)合物識(shí)別脂肽或脂蛋白,TLR3識(shí)別病毒的雙鏈RNA,TLR4識(shí)別脂多糖,TLR5識(shí)別鞭毛蛋白,TLR7和TLR8識(shí)別單鏈RNA,以及TLR9識(shí)別細(xì)菌的CpG-DNA。TLR5是一類限制性表達(dá)受體,主要表達(dá)在上皮細(xì)胞、單核／巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)等細(xì)胞的表面。鞭毛蛋白是TLR5的特異性配體,TLR5識(shí)別鞭毛蛋白后,啟動(dòng)MyD88依賴的信號(hào)通路,激活轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。目前,針對(duì)先天性免疫應(yīng)答的研究主要以人或小鼠為模型,而對(duì)于家禽的研究則較為少見,主要是由于缺乏與家禽相關(guān)的生物試劑材料。因此,本研究構(gòu)建表達(dá)了鴨TLR5分子的胞外區(qū)(ECD)片段,并制備了針對(duì)TLR5(ECD)的單克隆抗體,以期為家禽先天性免疫應(yīng)答研究提供材料。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期制備的鴨TLR5 cDNA為模板,設(shè)計(jì)合成引物,利用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增鴨TLR5 (ECD)基因片段,片段大小為1608 bp。將擴(kuò)增的目的基因片段連接于pMD20-T克隆載體,經(jīng)篩選鑒定正確后,將目的基因分別連接于原核表達(dá)載體pCold-1和pGEX-6p-l,經(jīng)篩選鑒定正確后,分別將構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒pCold-1-TLR5和pGEX-6p-1-TLR5轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21,從而構(gòu)建出重組菌pCold-1-TLR5/BL21和pGEX-6p-1-TLR5/BL21.將重組菌pCold-1-TLR5/BL21和pGEX-6p-1-TLR5/BL21分別接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中,加入IPTG誘導(dǎo)重組融合蛋白的表達(dá),收集菌體,超聲波裂解菌體,離心后分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,根據(jù)電泳結(jié)果判定,重組融合蛋白rHis-TLR5和rGst-TLR5均表達(dá)在包涵體中。以重組融合蛋白rHis-TLR5為免疫原免疫6-8周齡的雌性BALB/c小鼠,應(yīng)用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),通過(guò)間接ELISA方法和2次亞克隆篩選,獲得6株能夠穩(wěn)定的分泌抗TLR5單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1C10、485、589、5811、5F9和6D7。對(duì)獲得的6株細(xì)胞株分別進(jìn)行培養(yǎng)上清效價(jià)、腹水效價(jià)和抗體亞類測(cè)定。結(jié)果顯示,1C10、485、589和6D7的培養(yǎng)上清效價(jià)均在104以上；5811株腹水效價(jià)低于106,其余均在107�？贵w亞類鑒定顯示,5F9株為IgG1,其余5株均為IgM。對(duì)收集的腹水單克隆抗體進(jìn)行透析處理,然后用rProtein A Sepharose 4B親和層析柱純化,收集純化后抗體進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳顯示6株抗體的純化效果整體較好。Western blotting結(jié)果顯示,每株抗體均與經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌pCold-1-TLR5/BL21和pGEX-6p-1-TLR5/BL21發(fā)生特異性反應(yīng),出現(xiàn)與目的蛋白一致的特異性條帶,不與空載體重組菌pCold-1/BL21和pGEX-6p-1/BL21發(fā)生特異性反應(yīng)。將構(gòu)建的重組真核質(zhì)粒pCDNA3.1-TLR5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,分別以制備的6株單克隆抗體為一抗,以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),結(jié)果均可以觀察到明顯的熒光,表明所制備的單克隆抗體與真核表達(dá)的TLR5分子可發(fā)生特異性結(jié)合。將制備鴨脾臟淋巴細(xì)胞,以單克隆抗體5F9為一抗,以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,結(jié)果表明單克隆抗體5F9可以特異性的識(shí)別鴨脾臟淋巴細(xì)胞。本研究成功表達(dá)了鴨TLR5胞外區(qū)的蛋白片段TLR5(ECD),所獲得的單克隆抗體可與真核表達(dá)的鴨TLR5分子發(fā)生特異性的結(jié)合,并且單克隆抗體5F9可以用于流式細(xì)胞術(shù)分析,預(yù)示著抗體具有良好的應(yīng)用前景。
[Abstract]:Toll like receptors (Toll-like receptors TLRs) is a kind of transmembrane protein family, through the recognition of pathogen associated molecular patterns (Pathogen-associated molecular, patterns, PAMPs) induced innate immune response.TLRs is considered to be the most characteristic of the congenital receptors play an important role in the host anti infection immunity. Different TLRs specific molecular marker identification and initiate innate immune response, such as TLR2 and TLR3 complex or TLR2 and identification of TLR6 complexes of lipopeptide or lipoprotein, double stranded RNA virus TLR3 recognition, TLR4 recognition of LPS, TLR5 protein and TLR7 flagellin recognition, TLR8 recognition and identification of single stranded RNA, TLR9 the CpG-DNA.TLR5 of bacteria is a restricted expression receptor, mainly expressed in epithelial cells, monocytes / macrophages, dendritic cells (DC) surface cells. Flagellin is a specific ligand of TLR5, TLR5 to identify flagellar protein, start MyD88 Dependent signal pathway, activation of transcription factors (NF- K B) induced proinflammatory cytokine production. At present, the research on the innate immune response to human or mouse model for poultry research is relatively rare, is mainly due to the lack of raw materials and reagent of poultry related. Therefore, this study on construction of expression of duck TLR5 molecules of the extracellular domain (ECD) fragment, and prepared for TLR5 (ECD) monoclonal antibody, in order to provide materials for the response of poultry innate immunity. In this study, laboratory preparation of duck TLR5 cDNA as template, primers were designed and synthesized, using high fidelity DNA polymerase duck TLR5 (ECD) gene fragments was 1608 bp. amplified fragment of target gene connected to the cloning vector pMD20-T by screening after correct identification, the target genes connected to the prokaryotic expression vector pCold-1 and pGEX-6p-l, were screened by Kam Set right after, respectively construct the Prokaryotic Recombinant Plasmid pCold-1-TLR5 and pGEX-6p-1-TLR5 transformed into Escherichia coli BL21, to construct recombinant pCold-1-TLR5/BL21 and pGEX-6p-1-TLR5/BL21. recombinant strains pCold-1-TLR5/BL21 and pGEX-6p-1-TLR5/BL21 were inoculated in LB liquid medium containing Amp, adding expression of recombinant fusion protein induced by IPTG cells were collected, ultrasonic lysis bacteria, centrifugal after collecting the supernatant and precipitation respectively by SDS-PAGE gel electrophoresis according to the electrophoresis result, the recombinant fusion protein rHis-TLR5 and rGst-TLR5 were expressed in inclusion bodies. The recombinant fusion protein rHis-TLR5 were immunized 6-8 week old female BALB/c mice, lymphocyte hybridoma technique using B by indirect ELISA method and 2 sub clones obtained, 6 strains can stably secrete anti TLR5 monoclonal antibody hybridoma cell lines, named respectively For 1C104855895811,5F9 and 6D7. on the 6 cell lines were cultured supernatant titer, ascites titer and antibody subgroup determination. The results showed that the titer of supernatant of 1C10485589 and 6D7 were more than 104; 5811 strains of ascites was lower than 106, the rest are in the 107. antibody subtype identification showed that 5F9 strain was IgG1, the remaining 5 strains were collected on IgM. ascites monoclonal antibody for dialysis treatment, and then use the rProtein A Sepharose 4B affinity chromatography, the purified antibody was collected SDS-PAGE gel electrophoresis, electrophoresis showed that the purification effect of 6 strains of.Western blotting antibody better overall results show that each antibodies are specifically reacted with the recombinant bacteria induced by pCold-1-TLR5/BL21 and pGEX-6p-1-TLR5/BL21, appear consistent with the target protein specific bands, and the empty weight group of strains pCold-1/BL21 and pGEX-6p-1/BL21 specific response. The recombinant plasmid pCDNA3.1-TLR5 was transfected to HEK293T cells, 6 monoclonal antibodies were prepared for anti FITC labeled Goat anti mouse IgG two antibody, indirect immunofluorescence test, the results can be observed fluorescence indicated that the prepared monoclonal antibody and eukaryotic expression the TLR5 molecules can specific binding. The preparation of duck spleen lymphocytes, a resistance to monoclonal antibody 5F9, FITC labeled Goat anti mouse IgG two antibody, were analyzed by flow cytometry. Results showed that 5F9 monoclonal antibody can specifically identify duck spleen lymphocytes. This study successfully expressed protein fragment TLR5 duck TLR5 extracellular domain (ECD), combined with duck TLR5 monoclonal antibody was obtained from eukaryotic expression can be specific, and the monoclonal antibody 5F9 can be used for flow cytometry analysis indicates that the antibody has good Good prospects for application.

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.2

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本文編號(hào)：1737188