本文選題：瘤胃上皮細(xì)胞 + 生物鐘基因　； 參考：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：生物鐘基因廣泛存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中,胃腸道內(nèi)也存在生物鐘基因的表達(dá),且能夠影響胃腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),不同周齡湖羊瘤胃上皮組織的生物鐘基因均能夠表達(dá)。揮發(fā)性脂肪酸(Volatile fatty acid,VFA)作為瘤胃內(nèi)發(fā)酵的主要產(chǎn)物和反芻動(dòng)物的主要能量來(lái)源,且VFA能通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以吸收進(jìn)入瘤胃上皮細(xì)胞。為此,本論文旨在初步探討在瘤胃上皮細(xì)胞的揮發(fā)性脂肪酸吸收與其生物鐘因子表達(dá)的關(guān)系。研究主要包括以下部分:試驗(yàn)一、山羊瘤胃上皮原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)與生物鐘蛋白的免疫熒光鑒定試驗(yàn)通過(guò)連續(xù)0.25%胰蛋白酶消化法分離瘤胃上皮原代細(xì)胞,并使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫熒光法鑒定細(xì)胞角蛋白18的表達(dá)、CCK8法(Cellcounting8)測(cè)定細(xì)胞活性,體外添加15mmol/L 丁酸鈉測(cè)定瘤胃上皮細(xì)胞代謝丁酸的生物功能。同時(shí),使用免疫熒光法鑒定山羊瘤胃上皮細(xì)胞的CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白的表達(dá)。分析結(jié)果:原代培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)上呈鋪路石狀分布,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型,符合上皮細(xì)胞的典型的形態(tài)和生長(zhǎng)曲線。同時(shí),細(xì)胞能夠陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞角蛋白18,使用含有15mmol/L的丁酸鈉的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h能夠極顯著提高培養(yǎng)液中β-羥丁酸的產(chǎn)量(P0.01),符合瘤胃上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能,且體外瘤胃上皮細(xì)胞能夠陽(yáng)性表達(dá)CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白,存在生物鐘蛋白的表達(dá)。試驗(yàn)二、不同揮發(fā)性脂肪酸對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖活性和吸收速率的影響試驗(yàn)通過(guò)體外添加15 mmol/LVFA處理瘤胃上皮細(xì)胞包括乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉處理細(xì)胞6、12、24h,使用CCK8法測(cè)定各組細(xì)胞活力,并且使用液相色譜儀測(cè)定培養(yǎng)液中的VFA濃度。VFA處理24h后使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期,同時(shí),使用RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞周期基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)對(duì)照組的細(xì)胞活力顯著或極顯著高于VFA處理組(P0.05或P0.01)。丙酸組的細(xì)胞活力在12h和24h極顯著高于乙酸組和丁酸組(P0.01)。2)通過(guò)細(xì)胞周期的分析,VFA處理組的細(xì)胞處在G1期的比例極顯著高于對(duì)照組,且乙酸組和丁酸組極顯著高于丙酸組(P0.01)。3)細(xì)胞處理24 h后,處理液中丙酸組的丙酮酸濃度極顯著高于其他組(P0.01),丁酸組極顯著高于對(duì)照組和乙酸組(P0.01)。4)相比于對(duì)照組,VFA處理極顯著的抑制CCND1、CCNB1和CDK1和CDK2的相對(duì)表達(dá)(P0.01),且能夠下調(diào)CDK4的表達(dá),但是差異不顯著(P0.05)。5)不同VFA的吸收速率丁酸組最高,丙酸組次之,乙酸組最慢((P0.01),且培養(yǎng)液中的VFA濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而極顯著下降(P0.01)。試驗(yàn)三、瘤胃上皮細(xì)胞揮發(fā)性脂肪酸吸收蛋白和生物鐘因子表達(dá)的相關(guān)性研究試驗(yàn)通過(guò)體外添加15 mmol/LVFA處理瘤胃上皮細(xì)胞包括乙酸鈉、丙酸鈉、丁酸鈉處理細(xì)胞6 h、12 h、24h,研究不同VFA對(duì)細(xì)胞生物鐘和VFA吸收基因表達(dá)、以及基因表達(dá)的相關(guān)性的影響�；蛳鄬�(duì)表達(dá)量通過(guò)RT-PCR法測(cè)定,基因表達(dá)量的相關(guān)性分析使用皮爾森相關(guān)分析進(jìn)行。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1)VFA對(duì)于瘤胃上皮細(xì)胞生物鐘基因和吸收基因表達(dá)有不同程度的影響,VFA處理極顯著抑制Clock基因表達(dá)、而極顯著提高Bmal1基因和Per2基因的表達(dá)(P0.01),丁酸組的Per3基因極顯著高于其他組(P0.01)。丙酸組和丁酸組的Cry2極顯著高于對(duì)照組和乙酸組(P0.01)。VFA能夠顯著提高NR1D1和RORa的基因表達(dá),降低NR2F2、FBXW11的相對(duì)表達(dá)(P0.05),而對(duì)NCOR1沒有顯著影響(P0.05)。2)VFA處理對(duì)PPAR家族的基因表達(dá)存在不同的影響,丙酸組和丁酸組能夠極顯著上調(diào)PPARA的表達(dá)(P0.01),丙酸組的PPARD和PPARG的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P0.05)。3)VFA處理能夠極顯著提高PAT1,降低MCT1和MCT4基因的表達(dá)(P0.01),而對(duì)NHE1沒有顯著的影響(P0.05)。此外,不同VFA對(duì)于AE2、VH+ATPase的表達(dá)影響不一致。4)MCT1和MCT4基因表達(dá)與生物鐘因子存在極顯著的相關(guān)性(P0.01),Bmal1和PAT1的表達(dá)顯著相關(guān)(P0.05)。且生物鐘因子的表達(dá)與CCND1、CCNB1、CDK1和CDK2存在顯著的正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)(P0.05)。綜上,1)使用0.25%胰蛋白酶連續(xù)消化、培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞符合上皮細(xì)胞的形態(tài)、免疫化學(xué)、增殖活性的特點(diǎn)、并且具有相關(guān)的生物學(xué)功能,證明該細(xì)胞為山羊瘤胃上皮細(xì)胞。且瘤胃上皮細(xì)胞在體外能夠陽(yáng)性表達(dá)CLOCK蛋白和PERIOD2蛋白。2)VFA能夠通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白以及CDK的基因表達(dá),影響細(xì)胞G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變,從而抑制瘤胃上皮細(xì)胞DNA合成、并降低細(xì)胞增殖活力。不同VFA在體外吸收速率存在差異。3)VFA對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞的生物鐘基因和吸收基因有不同程度的影響,生物鐘基因的表達(dá)與細(xì)胞周期基因以及VFA吸收基因的表達(dá)存在相關(guān)性。
[Abstract]:In this paper , we studied the expression of biological clock gene in rumen epithelial cells by continuous 0.25 % trypsin digestion method . The results showed that : 1 ) The cell viability of rumen epithelial cells was significantly higher than that in VFA group ( P0.05 or P0.01 ) . Conclusion : 1 ) VFA can significantly increase the expression of the gene of the cell cycle protein and the expression of the gene , but also significantly improve the expression of the expression of the gene and the expression of the gene in the control group ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.2

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本文編號(hào)：1732676