本文選題：豬流行性腹瀉病毒　切入點(diǎn)：豬傳染性胃腸炎病毒　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)和豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis,TGE)這使兩種病毒是哺乳仔豬高致死率的主要原因,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何有效防治這兩種疾病是當(dāng)前亟待解決的問題,而對(duì)相關(guān)致病機(jī)理的研究可為有效防治提供理論依據(jù)。豬氨基肽酶(porcine aminopeptidase N,p APN)是一類鋅離子依賴性的膜結(jié)合II型金屬糖蛋白,存在于細(xì)胞表面,廣泛分布于哺乳動(dòng)物的多種組織細(xì)胞的表面,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸膜、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞、腎近曲小管上皮和肺臟細(xì)胞表面都有高水平的表達(dá),尤其在小腸微絨毛表面大量存在,主要功能是水解肽、酰胺等結(jié)構(gòu)中的酰胺鍵,從而釋放出不同的N-中性氨基酸。APN作用的天然底物包括血管作用肽、神經(jīng)肽激素、細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑等,因此它能參與很多重要過程的深度反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),PEDV和TGEV均以pAPN作為細(xì)胞感染受體,同時(shí)p APN的抗體可以有效阻斷p APN與PEDV和TGEV的結(jié)合。因此,制備抗p APN抗體及對(duì)其生物學(xué)特性的分析可以為有效防治PED和TGE提供理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究以天然p APN蛋白免疫BALB/c小鼠,按常規(guī)方法進(jìn)行融合,通過間接ELISA方法篩選,最終獲得2株抗p APN的雜交瘤細(xì)胞系(命名為3E5和2E3),這兩株細(xì)胞分泌的抗體亞類分別為IgG1和IgM,效價(jià)分別為1:1000和1:500。通過Western blot證實(shí)3E5株和2E3株分泌的抗體是針對(duì)p APN的SPC段(p APN 500aa-963aa段),且與天然p APN可發(fā)生特異性結(jié)合,免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)3E5株和2E3分泌的抗體可以與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞上的天然p APN蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。將抗p APN的單克隆抗體與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞作用后,再分別感染PEDV和TGEV,于接毒后24h、48h、72h在顯微鏡下觀察病變效果,結(jié)果表明,抗p APN的單抗可有效阻斷p APN受體,且IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞病變均被不同程度的抑制。進(jìn)一步收取吸附后、病毒感染24h和病毒感染48h的細(xì)胞感染物,提取RNA,通過熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù),并對(duì)這三組樣品進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果表明,經(jīng)p APN單克隆抗體作用后,細(xì)胞感染物中的病毒拷貝數(shù)顯著降低,表明抗p APN單抗有效地阻斷了p APN受體與病毒的結(jié)合,并進(jìn)一步抑制了病毒的繁殖。將p APN單克隆抗體分別做1:10、1:100和1:1000倍稀釋,將不同稀釋度的p APN單抗分別與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞作用后,再接種PEDV和TGEV,于病毒吸附后,收取細(xì)胞感染物,提取RNA,通過熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù),檢測分析不同濃度p APN單抗對(duì)p APN受體的阻斷作用。結(jié)果表明,不同濃度的pAPN單抗都具有阻斷p APN受體,抑制p APN受體與病毒結(jié)合,從而抑制病毒在細(xì)胞中的吸附的能力,且隨著單抗?jié)舛鹊慕档妥钄嘧饔靡搽S之降低。此外,將抗p APN的單克隆抗體與IEC-2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞作用后,再分別感染不同拷貝數(shù)的PEDV和TGEV,于病毒吸附后,收取細(xì)胞感染物,提取RNA,通過熒光定量PCR檢測病毒拷貝數(shù),檢測分析p APN單抗對(duì)p APN受體阻斷后對(duì)不同濃度病毒增殖的抑制作用。結(jié)果表明,p APN單抗對(duì)不同濃度的病毒都具有阻斷作用,且不同濃度病毒組p APN單抗對(duì)p APN受體的阻斷作用并無明顯差異。以上結(jié)果證明,3E5株和2E3株分泌的抗體對(duì)p APN具有較高的特異性和親和性,3E5株可有效阻斷p APN受體與TGEV的結(jié)合,并抑制TGEV在細(xì)胞中的感染和增殖,為進(jìn)一步設(shè)計(jì)抗病毒藥物、封閉病毒受體、阻止病毒感染等研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:It is found that both PEDV and TGEV can effectively prevent and control the binding of p APN to PEDV and TGEV . The effects of p APN monoclonal antibodies against p APN receptors on p APN receptors were investigated . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a blocking effect on p APN receptors . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a blocking effect on p APN receptors . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a high specificity and affinity for p APN receptors . The results showed that the monoclonal antibodies against p APN had a high specificity and affinity for p APN . and can inhibit the infection and proliferation of TGEV in cells , and lays a foundation for further designing antiviral drugs , blocking virus receptors , preventing virus infection , and the like .

【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4

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