本文選題：兔瘟病毒(RHDV)　切入點(diǎn)：Taq-Man探針　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease, RHD)又稱兔瘟,是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的一種感染成年兔的急性、烈性、高發(fā)病率和高致死率的傳染病,嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展。由于RHDV尚無穩(wěn)定的培養(yǎng)細(xì)胞,這影響著RHDV的細(xì)胞侵染機(jī)理和防控等方面的研究,加之RHDV近年新的變異毒株(RHDV2)的出現(xiàn)和流行,這為RHD的防治帶來了新的困難。因此本文將建立的Taq-Man實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)新出現(xiàn)的RHDV的變異株也進(jìn)行了特異性驗(yàn)證。同時(shí)進(jìn)行了RHDV的家兔和乳鼠感染檢測(cè)試驗(yàn),具體如下：根據(jù)兔瘟病毒VP60蛋白基因的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,克隆出986bp的RHDV VP60基因片段作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的陽性模板。在克隆陽性模板的目的片段區(qū)間,利用Beacon Designer 8軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物及1條探針,目的片段為173bp,在探針的5’端標(biāo)記FAM,3’端標(biāo)記TAMRA,建立Taq-Man實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法,并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過靈敏度試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)表明,建立的Taq-Man實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有較高的靈敏度和良好的特異性,適用于RHDV臨床樣品的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。對(duì)市場(chǎng)上買來未免疫過RHDV的10只成年家兔進(jìn)行RHDV感染,10只家兔3天內(nèi)死亡,對(duì)家兔的主要內(nèi)臟器官制作并觀察了病理切片,同時(shí)采集的家兔的主要內(nèi)臟器官各0.2g,血液200μL進(jìn)行病毒含量檢測(cè),結(jié)果顯示病死家兔具有典型的兔瘟病理組織學(xué)變化,且各內(nèi)臟器官中均含有RHDV,陽性率為100%,各個(gè)器官中含毒量大小依次為血漿,血細(xì)胞,肝臟,脾臟,心臟,腎臟,肺臟,肌肉。同時(shí)分別對(duì)乳鼠進(jìn)行了背部注射RHDV的體內(nèi)感染檢測(cè)和乳鼠主要臟器原代細(xì)胞培養(yǎng)后接毒的檢測(cè)試驗(yàn),結(jié)果顯示乳鼠在24h內(nèi)死亡,死亡乳鼠的各個(gè)臟器的RHDV含量檢測(cè)均為陽性,其中在腎臟和肺臟中的病毒含量較高。培養(yǎng)了乳鼠主要臟器的原代細(xì)胞,接種RHDV后,RHDV的檢測(cè)結(jié)果顯示,除了乳鼠腎臟原代細(xì)胞內(nèi)有微量RHDV的存在,其他臟器的原代細(xì)胞中RHDV的含量可疑。以上的研究為RHDV細(xì)胞侵染的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)和提供了科學(xué)參考。
[Abstract]:Rabbit hemorrhagic disease (RHD), which is caused by rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV), is an acute, acute, high morbidity and high mortality infectious disease of adult rabbits, which seriously endangers the development of rabbit breeding in the world.As there are no stable cultured cells in RHDV, this affects the study of cell infection mechanism and prevention and control of RHDV, in addition to the emergence and prevalence of new variant strain RHDV2 of RHDV in recent years, this brings new difficulties to the prevention and treatment of RHD.Therefore, the Taq-Man real-time quantitative RT-PCR detection method was used to detect the new variant strains of RHDV.A pair of primers were designed according to the sequence of VP60 protein gene of rabbit plague virus, and the RHDV VP60 gene fragment of 986bp was cloned as a positive template for real-time quantitative RT-PCR detection.A pair of primers and a probe were designed by using Beacon Designer 8 software in the region of the target fragment of the clone positive template. The target fragment was 173bp. Tamra was labeled at the 5 'end of the probe, and a real-time quantitative RT-PCR detection method for Taq-Man was established.The reaction conditions were optimized and the standard curve was drawn.The sensitivity test and specificity test show that the Taq-Man real-time quantitative RT-PCR has high sensitivity and good specificity and is suitable for rapid and accurate detection of RHDV clinical samples.Ten adult rabbits who had not been immunized with RHDV were infected with RHDV in the market. 10 rabbits died within 3 days. The main visceral organs of the rabbits were made and the pathological sections were observed.At the same time, the main visceral organs and 200 渭 L of blood collected from rabbits were detected for virus content. The results showed that the histopathological changes of rabbit plague were typical in the dead rabbits.RHDV was found in all visceral organs with a positive rate of 100. The virulence in each organ was plasma, blood cells, liver, spleen, heart, kidney, lung and muscle.At the same time, the infection of RHDV injected into the back and the infection of the primary cells of the main organs of the newborn rats were detected respectively. The results showed that the newborn mice died within 24 hours, and the RHDV content of each organ of the dead mice was positive.The virus content in kidney and lung is higher.Primary cells of main organs of newborn rats were cultured. After inoculation with RHDV, the results showed that there was a small amount of RHDV in the primary cells of the kidney, but the content of RHDV in the primary cells of other organs was suspicious.The above studies have laid a foundation for the study of the mechanism of RHDV cell infection and provided scientific reference.
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.291

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本文編號(hào)：1725048