本文選題：豬流行性腹瀉　切入點：N基因　出處：《南京農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：豬流行性腹瀉病(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是一種豬的消化道疾病,導致感染豬腹瀉、嘔吐,甚至脫水死亡,對仔豬影響極大,感染后死亡率接近100%。豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是該病的病原,屬于冠狀病毒,是一種單股正鏈RNA病毒,易變異,難以防控。該病1971年首次被發(fā)現(xiàn),之后一直存在于歐洲、亞洲等地的豬群中,但沒有大的爆發(fā),2010年我國出現(xiàn)了 PEDV變異毒株,并迅速傳播蔓延,對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。2013年,該病傳播至美國,同樣迅速席卷美國各地豬場,至今已蔓延至美洲許多國家。2014年底至2015年初,歐洲部分豬場也出現(xiàn)了該疾病的報道,病情仍在不斷擴大。除了對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失外,目前對冠狀病毒的研究表明,該病毒發(fā)生的變異,可能會導致其宿主細胞嗜性發(fā)生變化,即有可能發(fā)生變異后感染人類,2003年我國爆發(fā)的重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS),同屬于冠狀病毒,SARS造成的損失至今仍記憶猶新,我們應以此為鑒,對PEDV進行嚴格的防控,防止其對人類健康造成威脅。傳染病的防控中,對病原感染的早期準確診斷是及其重要的一環(huán)。目前對PEDV的診斷主要依靠RT-PCR方法,該方法操作繁瑣,依賴設備,養(yǎng)殖場與基層獸醫(yī)沒有條件進行檢測。而ELISA方法則操作簡便,沒有條件限制,能夠迅速進行檢測。利用重組PEDV抗原蛋白建立的間接ELISA方法,能夠?qū)ωi血清PEDV抗體水平進行檢測,該指標對疫苗免疫效果的評價也具有指導意義。母豬初乳中的母源抗體是斷奶前仔豬抵抗PEDV感染的重要免疫保護力來源,間接ELISA方法還可以對乳汁IgA抗體水平進行檢測,對仔豬免疫力的評價也具有指導意義。PEDV核衣殼蛋白(N蛋白)是一種重要的病毒抗原,感染機體后表達量大,感染早期即可檢測到PEDV N蛋白抗體,該抗原是建立間接ELISA方法的理想抗原。因此,本研究內(nèi)容主要包括如下2方面:1.對國內(nèi)流行的PEDV毒株N基因序列進行分析,選擇了具有代表性的毒株AH2012,以其N基因序列為模板,構建了原核表達載體pET-28a-N,成功表達出重組PEDV N蛋白,經(jīng)蛋白免疫印跡試驗驗證,該蛋白免疫原性良好。而且該蛋白在低溫誘導時為可溶性表達,能夠在實驗室內(nèi)大量制備并進行純化,為后續(xù)ELISA方法的建立與應用打下了良好基礎。2.使用該重組N蛋白建立了抗體檢測間接ELISA方法,并對各步驟進行了優(yōu)化。該方法檢測結果穩(wěn)定可靠,環(huán)境、溫度等條件影響小,靈敏度高,特異性良好,不與其他常見豬病陽性血清發(fā)生反應。同病毒中和試驗結果對比,各份檢測血清的中和抗體水平與N蛋白抗體水平符合率為96.3%。使用市售PEDV疫苗免疫仔豬,采血后使用該ELISA方法檢測仔豬血清抗體效價,結果可見二免后1個月內(nèi),抗體效價檢測值即可達到1:6400以上,且抗體水平消長變化符合自然免疫規(guī)律。隨后組裝并試制了 PEDV抗體檢測用間接ELISA試劑盒,該試劑盒檢測臨床血清時,同中和試驗相比,陽性符合率為90.77%;陰性符合率為80.0%。兩種檢測方法符合率良好。同時該試劑盒在2～8℃下,能夠保存至少9個月。該N蛋白間接ELISA方法可以應用于我國PEDV流行變異毒株的診斷、流行病監(jiān)測以及疫苗研發(fā)時的抗體水平檢測。后續(xù)還將對該N蛋白抗原檢測初乳IgA抗體的ELISA方法進行研究。為PEDV的防控提供一種有效的實用工具。
[Abstract]:Porcine epidemic diarrhea virus ( PED ) is a kind of pig ' s digestive tract disease , which leads to diarrhea , vomiting and even dehydration death of pigs . It has been found in the swine herds in Europe , Asia and so on . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the epidemic spread to many countries in America . In 2013 , the disease spread to many countries in America . In 2013 , the disease spread to many countries in America . In 2013 , the disease spread to many countries in America . An indirect ELISA kit for the detection of anti - PEDV antibody against PEDV was established .

【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651

【參考文獻】

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本文編號：1723876