本文選題：豬流感　切入點(diǎn)：通用疫苗　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：大約90年前,豬流感病毒首次被證實(shí),盡管在過(guò)去的50年內(nèi),豬流感引起了廣泛的關(guān)注,但它仍然是養(yǎng)豬業(yè)存在的隱患,同時(shí)也對(duì)人類健康帶來(lái)威脅。在二十世紀(jì)人流感的4次大流行、大爆發(fā)過(guò)程中,有三次與豬流感相關(guān),分別是1957、1968和2009流感的大流行。H5亞型高致病性禽流感自從1996年在廣東的家鵝的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)后,2003年開(kāi)始在中國(guó)大規(guī)模的流行。近些年來(lái),在中國(guó)、越南和埃及的豬群的流行病學(xué)調(diào)查中,發(fā)現(xiàn)H5亞型高禽流感病毒的已經(jīng)開(kāi)始在豬群內(nèi)適應(yīng),H5亞型高致病性禽流感病毒可能會(huì)通過(guò)在豬群的適應(yīng),獲得人傳人的能力,由于H5亞型高致病性流感病毒在人類感染后,具有高達(dá)60%的致死率,這將會(huì)給人類帶來(lái)巨大的災(zāi)難。高致病性禽流感H5亞型的病毒經(jīng)過(guò)十多年的遺傳進(jìn)化,已經(jīng)演化出了10個(gè)亞類。其中,1、2和7亞類進(jìn)一步分化出二級(jí)亞類、三級(jí)亞類等。如此高度分化的遺傳學(xué)性質(zhì)給疫苗研發(fā)帶來(lái)了挑戰(zhàn)和巨大的經(jīng)濟(jì)壓力。在本次研究中我們選擇了在遺傳進(jìn)化樹(shù)與共有序列(Consensus Sequence)距離最近的病毒株A/Thailand/406H/04(H5N1)作為免疫原,以BALB/c小鼠為動(dòng)物模型,用表達(dá)A/Thailand/1(KAN)-1/04(H5N1)HA蛋白的DNA質(zhì)粒免疫兩次,用含有A/Thailand/1(KAN)-1/04(H5N1)病毒株的表面膜蛋白HA和NA的病毒樣顆粒(VLP)加強(qiáng)免疫一次(這種異源性免疫策略簡(jiǎn)稱為T(mén)H DDV)。在最后一次免疫后14天分析免疫后小鼠的CD8 T細(xì)胞的激活程度,根據(jù)活化的T細(xì)胞的數(shù)量和分泌的細(xì)胞因子的水平來(lái)評(píng)價(jià)免疫小鼠體內(nèi)細(xì)胞免疫的水平。用假病毒中和實(shí)驗(yàn)、血凝抑制實(shí)驗(yàn)、微孔中和實(shí)驗(yàn)和蝕斑減少實(shí)驗(yàn)等多種檢測(cè)手段來(lái)確定免疫鼠體內(nèi)中和性抗體對(duì)同亞型不同亞類的病毒株的中和效果。我們也檢測(cè)了免疫血清對(duì)不同亞型病毒株HA蛋白的結(jié)合情況和對(duì)這些病毒株的中和效價(jià)。隨后,用活病毒對(duì)免疫小鼠進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)這種免疫策略的體內(nèi)保護(hù)效果。用攻毒后免疫小鼠的體重和存活情況來(lái)評(píng)價(jià)疫苗所提供的保護(hù)程度,用肺臟內(nèi)的病毒載量來(lái)評(píng)價(jià)免疫后小鼠對(duì)病毒感染后的清除水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TH DDV免疫策略不僅可以誘導(dǎo)出較高的T細(xì)胞免疫水平,還可以誘導(dǎo)出廣譜的中和性抗體,這些抗體不僅可以中和所有的H5亞型10個(gè)亞類的和亞亞類代表毒株的假病毒和一些亞類的真病毒,還可以中和來(lái)自不同亞型的流感病毒株。結(jié)合性抗體檢測(cè)顯示TH DDV免疫血清可以結(jié)合H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16亞型的流感HA蛋白。THDDV免疫小鼠可以對(duì)同亞型的不同亞類病毒的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫攻毒提供完全的保護(hù),對(duì)不同亞型的流感病毒也有一定的保護(hù)效果。隨后,我們發(fā)現(xiàn)這種免疫策略的主要中和性抗體的表位在HA蛋白的頭部,也就是說(shuō)HA蛋白的頭部存在保守的中和表位。然后以豬為動(dòng)物模型,用DNA質(zhì)粒免疫兩次,病毒樣顆粒(VLP)加強(qiáng)免疫一次后采集免疫血清,用假病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示有較廣譜的中和效果。由于上面的研究發(fā)現(xiàn)THDDV免疫血清主要的廣譜性中和抗體是由HA頭部區(qū)域的保守表位產(chǎn)生的,為了進(jìn)一步提高HA頭部區(qū)域的保守表位產(chǎn)生的中和性抗體的效價(jià)和廣譜性,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了表位依賴的流感通用疫苗。TH DDV免疫血清所針對(duì)的HA頭部蛋白的保守表位,由于它誘導(dǎo)的中和性抗體的滴度不高,為了提高HA頭部蛋白的保守表位誘導(dǎo)的中和抗體的滴度,將HA頭部蛋白的保守表位放在一個(gè)可以產(chǎn)生高中和性抗體滴度的骨架蛋白上,構(gòu)建了嵌合體的免疫原,以BALB/c小鼠為動(dòng)物模型,用表達(dá)嵌合體HA蛋白的DNA質(zhì)粒免疫兩次,用含有嵌合體HA蛋白的病毒樣顆粒(VLP)加強(qiáng)免疫一次。免疫后分析免疫血清所識(shí)別的HA蛋白的表位和評(píng)價(jià)嵌合體的免疫原的免疫效果。結(jié)果顯示:這種免疫策略產(chǎn)生了HA表位特異性的中和性抗體,而且這種抗體由于抗原表位的減少而顯示更高的、更廣譜的抗體反應(yīng)。免疫后小鼠的攻毒實(shí)驗(yàn)顯示:這種免疫策略不僅可以保護(hù)相同亞型流感的病毒的感染,也可以保護(hù)不同亞型流感的病毒的感染。同樣在以豬為動(dòng)物模型,檢測(cè)免疫血清也有很好的廣譜性。本次研究為豬流感通用疫苗的研究提供了新的思路:1)選擇離共有序列較近的病毒株作為免疫原,用DNA初免和病毒樣顆粒加強(qiáng)免疫的策略;2)利用抗原表位減少的方式去設(shè)計(jì)表位疫苗。
[Abstract]:About 90 years ago, the swine flu virus was confirmed for the first time, although in the past 50 years, the swine flu has aroused widespread concern, but it is still a pig industry existence hidden danger, also pose a threat to human health. In twentieth Century 4 pandemic influenza outbreak, in the process, with three the swine flu related, were 19571968 and 2009.H5 influenza pandemic avian influenza since 1996 found home in Guangdong goose, beginning in 2003 China large-scale epidemic. In recent years, in Chinese, epidemiological investigation of Vietnam and Egypt pigs in, found H5 subtype the bird flu virus has started to adapt in pigs, H5 subtype of highly pathogenic avian influenza virus in pigs may be through the adaptation, the ability to obtain human transmission, because the H5 subtype of highly pathogenic avian influenza virus infection in humans, with the death of up to 60% This rate, it will bring great disaster to human beings. The highly pathogenic avian influenza H5 virus through the evolution of more than 10 years, has evolved in 10 subgroups. Among them, 1,2 and 7 subtypes of further differentiation of level two sub categories, three sub categories. So highly differentiated Nature Genetics for vaccine development challenges and tremendous economic pressure. In this study we chose in the phylogenetic tree and sequence (Consensus Sequence) from the nearest virus strain A/Thailand/406H/04 (H5N1) as immunogen, using BALB/c mice as animal models, with the expression of A/Thailand/1 (KAN) -1/04 (H5N1) DNA plasmid immune HA protein two, containing A/Thailand/1 (KAN) -1/04 (H5N1) virus like particles of virus membrane protein HA and NA (VLP) a second immunization (referred to as the heterologous immunization strategy for TH DDV). In the last 14 days after immunization of free The degree of activation of mouse CD8 T cells after disease, immune cell immunity of mice in vivo evaluation according to the number of activated T cells and cytokines level level. With a fake virus neutralization test, hemagglutination inhibition test, micro neutralization assay and plaque reduction test and other testing means to determine the immune rats in vivo antibodies of the same subtype in different subgroups of virus neutralizing effect. We also detected the immune serum with HA protein in different subtypes of the virus strains and the virus neutralization titer. Subsequently, with live virus on the immune mice were challenged in vivo experiments to test the protective effect of the immunization strategy used to immunize mice after infection. The body weight and survival to evaluate the degree of protection provided by the vaccine, the virus load in the lung of immunized mice to evaluate the virus clearance levels in experiments. The results showed that T cell immunity level TH DDV immunization strategy can not only induce higher, neutralizing antibodies can also induce broad-spectrum, these antibodies can not only neutralize all H5 subtypes of 10 subtypes and strains of the virus like Yaya and some subtypes of true virus, influenza virus strains can also neutralize from different subtypes. The combination of antibody detection showed that TH immune serum DDV can be combined with H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, HA flu protein in mice immunized with.THDDV H15 and H16 subtypes of with different subtypes subtype virus active immunization and passive immunity to provide complete protection to different subtypes of influenza viruses also have a protective effect. Then, we found the head immune strategy main neutralizing antibody epitopes in HA protein, that is conserved in the presence of HA protein in the head And then the epitope. The pig animal model with DNA immunized two times, virus like particles (VLP) collected after a second immunization serum with pseudotyped virus neutralization assay showed a broad-spectrum neutralization effect. Due to the above findings THDDV the main immune serum neutralizing antibody by broad spectrum table HA conservative head region position, in order to further improve the HA head region of conserved epitopes of neutralizing antibody titer and broad spectrum, the experimental design of conservative table HA head protein dependent universal influenza vaccine.TH DDV immune serum against the titer of neutralizing antibodies, because it induces the high titer of HA, in order to improve the head protein conserved epitope induced neutralizing antibody, HA head protein conserved epitopes in a high school and can produce antibody skeleton protein, constructed the chimeric The immunogen, using BALB/c mice as animal models, chimeric HA protein expression by DNA plasmid immunized two times, virus like particles containing the chimeric HA protein (VLP) at a time. To strengthen the immune epitope identification and evaluation of immune serum HA protein immune analysis of chimerism after immunogen immune effect. The results showed that this immunization strategy produced neutralizing antibody HA epitope specific antibody, and this epitope due to reduced and showed higher, more broad-spectrum antibody response. According to experimental mice after immunization challenge: this immunization strategy can not only protect the same subtype of influenza virus infection, also can protect the different subtypes of influenza virus infection in pigs. The same as animal model, detection of immune serum also have broad spectrum very well. This study provides a new way for the study of porcine universal influenza vaccine: 1) to choose from The more closely related virus strains were used as immunogen, the strategy of enhancing immunity with DNA primer and virus like particles. 2) design epitope vaccine by reducing the antigen epitope.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.4

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本文編號(hào)：1703863