本文選題：枯草芽孢桿菌　切入點：降解蛋白　出處：《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：枯草芽孢桿菌是重要的益生菌飼料發(fā)酵劑菌種,而不同種動物腸道內(nèi)枯草芽孢桿菌在降解飼料蛋白能力上的差異及編碼降解蛋白酶基因有何特點,是值得深入研究的課題。它有助于我們了解枯草芽孢桿菌在不同動物腸道中的生長活力、蛋白酶活力和酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,這對開發(fā)應(yīng)用于豬、禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生物制劑有著重要的意義。本研究選用從本實驗室已分離篩選到的三株性狀優(yōu)良且不同來源的枯草芽孢桿菌(分別是魚源A7株、豬源H6株和雞源S1株)。通過單因子試驗設(shè)計優(yōu)化種子培養(yǎng)基,確定了A7株、H6株和S1株的最佳培養(yǎng)溫度是28℃、37℃和39℃,以及最佳培養(yǎng)pH值是pH7.0、pH7.0和pH6.8。采用正交設(shè)計對菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化試驗,確定了三株菌株的最佳固體發(fā)酵條件均為：裝料量40g/250ml、接種量5%和固體發(fā)酵時間48h。在上述最佳固體發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上制作菌粉,A7株菌粉中活菌數(shù)可達8.90×109CFU/g,H6株可達5.60×1010CFU/g和S1株可達6.80×1010CFU/g,三種菌粉中芽孢率均在90%左右。菌株保存期內(nèi)的復(fù)活試驗結(jié)果顯示,A7株在保存期內(nèi)復(fù)活效果最好,H6株次之,S1株最差。A7菌株的復(fù)活率和芽孢率均較穩(wěn)定,至保存期3月,A7株菌粉含菌量為6.34×109CFU/g,芽孢含量為5.13×1O9CFU/g,菌粉中芽孢率仍達到80%以上,芽孢復(fù)活率為78.86%,,且菌粉于4℃條件下保存比相同環(huán)境常溫保存更穩(wěn)定。菌株降解蛋白能力試驗結(jié)果顯示,A7株H6株S1株。H6株和S1株降解蛋白能力相似,且S1株降解酪蛋白能力最差。飼料樣本經(jīng)粗酶液酶解后,A7株試驗組豆粕和玉米粉的降解率分別可達：53.13%和11.17%,比對照組提高了17.64%和7.49%；對豆粕和玉米粉的蛋白水解度(DH)為可達：28.06%和17.31%,比對照組提高了16.42%和8.44%。利用菌株的DNA為模板,成功擴增并測序出菌株的蛋白酶基因,測序結(jié)果顯示該片段大小均為1579bp,與部分芽孢桿菌屬間的中性蛋白酶基因序列同源性達99%以上。三菌株間核苷酸編碼區(qū)序列相似性為99.30%,推到出的氨基酸相似性為99.47%。酶結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,三株菌株的中性蛋白酶均為分子量中等大小,性質(zhì)穩(wěn)定的α/β型蛋白。本研究表明,來源于魚、豬和雞的枯草芽孢桿菌在培養(yǎng)條件以及對飼料蛋白降解上有明顯的差異。從編碼蛋白酶基因的核酸序列及推出的氨基酸序列和酶分子大小看,三菌株之間蛋白酶基因序列同源性較高,均屬于中性蛋白酶范疇,一級結(jié)構(gòu)存在8個氨基酸位點差異,蛋白酶空間結(jié)構(gòu)較為一致,然而從蛋白酶功能上看,A7株蛋白酶降解力遠遠高于H7和S1株。因此推測,導(dǎo)致三株菌在降解飼料蛋白能力的差異主要是因編碼菌株蛋白酶的核酸序列的不同所致,由此推導(dǎo)出的這8個氨基酸差異位點正是影響酶功能的關(guān)鍵性位點。
[Abstract]:Bacillus subtilis is an important probiotic feed starter strain , and the difference of Bacillus subtilis in the ability of degrading feed protein and the characteristic of coding and degrading protease gene are important to us to understand the growth vigor , protease activity and enzyme structure stability of Bacillus subtilis in the intestinal tract of different animals . The best solid fermentation conditions were as follows : loading quantity 40g / 250 ml , inoculation quantity 5 % and solid fermentation time 48 h . The best solid fermentation conditions were as follows : loading quantity 40g / 250 ml , inoculation quantity 5 % and solid fermentation time 48 h . The growth rate and spore rate of the strain were 8.90 脳 10 9 CFU / g and 5.13 脳 10 9 CFU / g .
The protein hydrolysis degree ( DH ) of soybean meal and corn meal was 28.06 % and 17.31 % , which was 16.42 % and 8.44 % higher than that of control group .

【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S816

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