本文選題：雞　切入點(diǎn)：pBF2~*1201復(fù)合體　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：細(xì)胞免疫應(yīng)答是雞免疫系統(tǒng)中的重要組成部分,其在抵御病原入侵、保護(hù)機(jī)體健康方面發(fā)揮著重要作用,其中CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)在抗病毒感染中扮演重要角色。CTL反應(yīng)的激活是依賴(lài)主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility Complex,MHC)Ⅰ類(lèi)分子將胞內(nèi)降解加工的抗原多肽遞呈給T細(xì)胞受體(Tcell receptor,TCR)。雞的MHCI又稱(chēng)為BF2,雞群中主要分布的等位基因包括BF2,*0201、BF2*0401、BF2*1501、BF2*2101、BF2a*1201等。然而,BF2*1201的結(jié)構(gòu)與功能迄今尚未解析,其呈遞病毒多肽的機(jī)理也尚未闡明。首先,本文運(yùn)用大腸桿菌系統(tǒng)分別表達(dá)BF2*1201的胞外區(qū)、禽源β2m蛋白,將BF2*1201重鏈、輕鏈分別同致瘤(vSRC)源性及禽流感源性抗原多肽進(jìn)行體外共復(fù)性,篩選到親和力較強(qiáng)多肽A6(AVKGVGTMV)、P1、P2、A1以及vSRC(LPACVLEV)。根據(jù)以上數(shù)據(jù),初步推斷BF2*1201結(jié)合多肽的錨定基序?yàn)閄(V/A/P/E)XX(V/I)XX(V/M)。進(jìn)一步將BF2a*1201分子結(jié)合多肽的復(fù)合物進(jìn)行純化、結(jié)晶試驗(yàn)并最終得到BF2*1201-vSRCLV8-Chβ2m及BF2*1201-A6AV9-Chβ2m高質(zhì)量的復(fù)合物晶體。然后,通過(guò) X 光晶體衍射法解析了 BF2*1201-vSRCLV8-Chβ2m 及 BF2*1201-A6AV9-Chβ2m 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),展示了 MHCI抗原結(jié)合槽的口袋氨基酸組成及抗原多肽與結(jié)合槽的作用力關(guān)系,發(fā)現(xiàn)BF2*1201分子中B、.C、F 口袋對(duì)結(jié)合抗原多肽較為重要。分析比較兩條多肽的遞呈構(gòu)象,發(fā)現(xiàn)BF2*1201遞呈九肽構(gòu)象時(shí)P8位殘基"代替"P9位殘基,其側(cè)鏈插入F 口袋中,P9位殘基側(cè)鏈構(gòu)象伸出結(jié)合槽C端,BF2*1201分子的R83側(cè)鏈向結(jié)合槽外側(cè)擺動(dòng),形成"Open back door"式構(gòu)象。這種MHCI類(lèi)分子獨(dú)特的結(jié)合槽C端開(kāi)放式結(jié)構(gòu),在已解析的禽類(lèi)MHCI類(lèi)分子結(jié)構(gòu)中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。在某種程度上,禽類(lèi)MHCI可能存在對(duì)稱(chēng)式的多肽錨定基序(-X-----X-),錨定殘基為PN+1和PC-1。利用生物信息學(xué)方法對(duì)R83進(jìn)行了相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)它在大多數(shù)低等脊椎動(dòng)物包括爬行類(lèi)、兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、禽類(lèi)的MHCⅠ類(lèi)分子中均保守;在哺乳類(lèi)動(dòng)物中為保守的Y(Tyr);在已知其他的MHC Ⅱ類(lèi)分子中,對(duì)應(yīng)位點(diǎn)也為較保守的R(Arg)。這種MHCⅠ與Ⅱ結(jié)合槽殘基與多肽相互作用的保守性為證實(shí)MHCⅠ起源于MHCⅡ的假說(shuō)提供了一定的證據(jù)。接著,我們將vSRCLV8和A6AV9多肽N端第2位、第5位及第8位殘基分別進(jìn)行了 Gly(G)的突變替代,將突變多肽分別同BF2*1201分子進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化復(fù)性及蛋白的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:多肽N端第2位、第5位以及第8位殘基側(cè)鏈變短后,多肽同目標(biāo)分子結(jié)合能力下降明顯,其中多肽N端第5位(P5)和第8位(P8)殘基尤為重要,具有顯性錨定特征。我們延長(zhǎng)了 BF2*1201分子洗脫多肽的C端,通過(guò)復(fù)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了目標(biāo)分子能夠遞呈結(jié)合C端延長(zhǎng)突變多肽的推論。最后,結(jié)合解析的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,我們?cè)O(shè)計(jì)數(shù)組合適的雞禽流感T細(xì)胞表位分別同禽流感滅活Re-6株抗原一同免疫SPF雞群,監(jiān)測(cè)免疫動(dòng)物的抗體水平及相關(guān)細(xì)胞因子(IFN-γ及IL-4)表達(dá)水平變化。最終,我們發(fā)現(xiàn)多肽PS0804及PS0816對(duì)禽流感滅活抗原的抗體效價(jià)水平均有顯著的提升作用,并且PS0804對(duì)細(xì)胞免疫應(yīng)答亦有一定的促進(jìn)作用。這部分工作嘗試為禽流感多肽表位疫苗的研制打下了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究首次解析了 BF2*1201分子的晶體結(jié)構(gòu),闡明了其遞呈抗原多肽的機(jī)理,發(fā)現(xiàn)了禽類(lèi)抗原結(jié)合槽的新特點(diǎn)及BF2*1201分子多肽錨定基序新特征;結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選得到有效的雞禽流感T細(xì)胞表位,為T(mén)細(xì)胞表位在疫苗生產(chǎn)方面的應(yīng)用總結(jié)了寶貴的經(jīng)驗(yàn),也為設(shè)計(jì)合適的新型禽用表位疫苗奠定理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:The cellular immune response plays an important role in resisting pathogen invasion and protecting organism ' s health , in which CD8 + T cell - mediated cytotoxic T lymphocytes ( CTL ) plays an important role in antiviral infection . The activation of CTL response is dependent on the major Histocompatibility Complex ( MHC ) class 鈪，

本文編號(hào)：1700259