本文選題：小反芻獸疫病毒　切入點：H蛋白　出處：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是一種急性的接觸傳播的傳染病。致病原是小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV)。血凝素蛋白(H蛋白)在PPRV侵染過程中負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞的受體結(jié)合,能夠刺激機體產(chǎn)生保護性免疫。本研究采用改良的生物合成肽法,以抗重組PPRV H蛋白免疫兔血清為一抗,利用Western blot來開展PPRV H蛋白的線性B細(xì)胞表位作圖研究。本文主要進(jìn)行了以下研究:1.包含線性B細(xì)胞表位16肽片段的篩選首先,設(shè)計合成覆蓋PPRV H蛋白序列全長的、相互重疊8個氨基酸殘基的系列16肽編碼DNA序列;在序列的5’端添加Bam H Ⅰ酶切位點序列,在序列的3’端添加TAA-Sal Ⅰ酶切位點序列;體外退火后連接至pXXGST-3原核表達(dá)載體,得到重組16肽表達(dá)載體pXXGST-3-P75-(1~75)。測序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL 21感受態(tài)細(xì)胞,SDS-PAGE篩選陽性克隆。以抗重組H蛋白免疫兔血清作為一抗,利用Western blot篩選出陽性反應(yīng)性的16肽片段,從75個GST融合表達(dá)的16肽中,獲得了14個陽性反應(yīng)性的16肽,分別為P1、P9、P10、P11、P13、P28、P45、P46、P47、P48、P58、P60、P63和P74。2.陽性16肽最小線性B細(xì)胞表位基序鑒定然后,設(shè)計合成覆蓋各個陽性反應(yīng)性的16肽序列全長的、相互重疊7個氨基酸殘基的系列8肽編碼DNA序列;在序列的5’端添加Bam H Ⅰ酶切位點序列,在序列的3’端添加TAA-Sal Ⅰ酶切位點序列;體外退火后連接至pXXGST-3原核表達(dá)載體,得到系列重組8肽表達(dá)載體。測序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL 21感受態(tài)細(xì)胞,SDS-PAGE篩選陽性克隆。以抗重組H蛋白免疫兔血清作為一抗,利用Western blot鑒定陽性反應(yīng)性的16肽的最小表位基序。結(jié)果表明除了對應(yīng)于P13的系列8肽全部為陰性反應(yīng),其最小表位基序需要進(jìn)一步確定外,在對應(yīng)其它16肽的系列8肽中均篩選到1-6個陽性反應(yīng)性的8肽。共得到12個最小的線性B細(xì)胞表位基序,分別為:~8INA10(in P1),~(73)RLNTNIKL~(80)(in P10),~(84)IDHQT88(in P11),~(224)EEGLFGRT~(231)(in P28),~(359)KDDEANW~(365)(in P45),~(367)VPSTDV~(372)(in P46),~(372)VRDLQ~(376)(in P47),~(383)VEACKTR~(389)(in P48),463FLGMINT470(in P58),~(478)VMPHILT484(in P60),~(504)VDDDIK~(509)(in P63)和~(590)TDEEVHT~(596)(in P74)。3.陽性16肽P13最小線性B細(xì)胞表位基序鑒定由于對應(yīng)于陽性16肽P13蛋白的系列8肽的Western blot結(jié)果全為陰性,所以我們采用依次縮短肽法鑒定其最小表位基序。設(shè)計并合成從N-端和C-端依次減少1-7個氨基酸殘基的系列15-9肽編碼DNA序列,體外退火并連接至pXXGST-3原核表達(dá)載體,得到系列重組9-15肽表達(dá)載體。測序驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL 21感受態(tài)細(xì)胞,SDS-PAGE篩選陽性克隆。以抗重組H蛋白免疫兔血清作為一抗,利用Western blot鑒定P13的最小表位基序。得到一個10肽的最小表位基序:~(98)ⅡGDEVGIRI~(107)。4.最小線性B細(xì)胞表位疫苗免疫羊血清抗體可及性驗證以疫苗株P(guān)PRV 75/1免疫羊血清作為一抗,利用Western blot來驗證獲得的H蛋白的線性B細(xì)胞表位的最小表位基序的抗體可及性。結(jié)果表明獲得的13個最小B細(xì)胞表位基序中,9個具有PPRV疫苗免疫羊血清反應(yīng)性。5.PPRV H蛋白的線性B細(xì)胞最小表位基序的3D建模為了闡述識別的線性B細(xì)胞表位的13個最小表位基序在PPRV H蛋白上的空間位置,我們通過Phyre2服務(wù)器進(jìn)行密集建模。預(yù)測結(jié)果表明,H蛋白頭域的412個殘基(約占89%)以大于90%的置信度建模。然而,胞尾和莖區(qū)沒有一個殘基的建模置信度大于90%。繪制的線性B細(xì)胞最小表位基序分布在預(yù)測環(huán)、β-折疊和螺旋的區(qū)域,并且鑒定的線性B細(xì)胞13個最小表位基序中的10個暴露在預(yù)測3D結(jié)構(gòu)的表面,表明它們都可能是抗體可接近的線性B細(xì)胞表位基序,羊抗體鑒定結(jié)果也證明這10個暴露表位中有8個是抗體可及性的表位。其余3個線性B細(xì)胞表位基序幾乎完全埋在PPRV H蛋白內(nèi),其中一個埋藏表位與羊血請抗體有弱陽性反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李世芳;邵軍軍;�；菔|;;口蹄疫表位疫苗的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2017年02期

2 劉祥;孔智翔;殷書平;毆莎莎;劉成艷;同韓虎;吳三橋;陳琛;陳春琳;;奶牛乳房炎重要候選疫苗蛋白的抗原表位分析及三聯(lián)重組表位疫苗的氨基酸序列設(shè)計[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2016年09期

3 馬凡舒;張蕾;王洋;胡博;呂爽;李欣彤;凌明玉;范思寧;張海玲;薛向紅;廉士珍;閆喜軍;;水貂阿留申病病毒NS1蛋白B細(xì)胞抗原表位的分析與鑒定[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2016年02期

4 郭春艷;趙向絨;胡軍;;B細(xì)胞抗原表位的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2013年02期

5 何玲;陳瑞愛;羅滿林;裴仉福;;多表位基因工程疫苗的研究進(jìn)展[J];廣東畜牧獸醫(yī)科技;2011年02期

6 楊彥;戴宗;鄒小勇;;表面等離子體共振技術(shù)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用[J];分析測試學(xué)報;2009年11期

7 陳建國;蘇兆亮;柳迎昭;王勝軍;黃新祥;邵啟祥;許化溪;;MyD88-銅綠假單胞菌表位核酸疫苗的構(gòu)建及其真核表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年03期

8 張小麗;田美娜;盧曾軍;付元芳;馬小軍;劉在新;謝慶閣;;FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2C主要表位區(qū)與3AB基因的組合表達(dá)與活性分析[J];生物工程學(xué)報;2009年01期

9 張中旺;張永光;;口蹄疫表位疫苗的研究進(jìn)展[J];中國人獸共患病學(xué)報;2008年06期

10 張有峰;王紅寧;黃勇;陽泰;;多表位疫苗的構(gòu)建策略及其在動物疫苗中的應(yīng)用[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報;2008年02期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 于欽磊;隱孢子蟲CP12/CP21雙價核酸疫苗的研究[D];吉林大學(xué);2008年

，

本文編號：1699973