本文選題：H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒　切入點：生物反應(yīng)器　出處：《吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：禽流感病毒(AIV)是一種人畜共患傳染病的病原體,影響著全球人類的所有經(jīng)濟和健康問題。大多數(shù)禽流感病毒亞型很少甚至不能引起水禽患病,但家禽中爆發(fā)禽流感與死亡率高密切相關(guān)。雖然禽流感病毒很少傳播給人類,該病毒經(jīng)過突變或重組后具有引發(fā)危及生命的感染能力。新的流感病毒株的不斷出現(xiàn),使預(yù)測其表現(xiàn)、傳播、毒力或人與人之間的傳播潛力頗具挑戰(zhàn)性。由于很難預(yù)測哪些病毒株或什么位置突變將引起下一次流感大流行,所以很難提前做好準(zhǔn)備。疫苗接種能夠起到有效預(yù)防作用,因此研究新型疫苗尤為重要。流感重組腺病毒疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細胞免疫,且重組腺病毒載體具有穩(wěn)定性好、安全性高和宿主范圍廣等優(yōu)點,近年來受到人們廣泛的關(guān)注,具有良好的發(fā)展前景。生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)由于其培養(yǎng)表面積大、易于對細胞進行實時檢測和控制,在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。陰離子交換層析具有靈敏度高、選擇性好、分離速度快等優(yōu)點,分子篩層析具有操作條件溫和、對于高分子物質(zhì)分離效果好等優(yōu)點,目前這兩種層析純化方法較為常用。本實驗室構(gòu)建了以季節(jié)性流感H5亞型和大流行性流感H1亞型HA(HA1)基因為主,以禽流感H1、H7和H9亞型HA抗原Th表位及M1表位為表達盒的重組腺病毒疫苗。通過7L生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)系統(tǒng)對H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒進行大量培養(yǎng),將發(fā)酵產(chǎn)物處理后,采用陰離子交換層析和分子篩層析進行純化,鑒定正確后,進行安全性評價試驗。生物反應(yīng)器培養(yǎng)HEK-293細胞,經(jīng)過多次優(yōu)化試驗,確定培養(yǎng)參數(shù)為:溫度:37℃、pH:6.9、攪拌速率:30r/min、溶氧:50%、CO2濃度:5%。培養(yǎng)24h后,85%以上細胞貼壁微載體,24-36h細胞增長率較高,48h更換培養(yǎng)液,84h細胞總數(shù)增長了4倍,之后細胞生長呈現(xiàn)下降趨勢。利用生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)技術(shù)大量擴增H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒,當(dāng)HEK-293細胞長滿微載體表面80-90%時,以5MOI接種H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒,48h后收取病毒液,處理后測得病毒滴度為1.0×1010TCID50/mL。利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒的病毒滴度為1.0×1010TCID50/mL,經(jīng)過陰離子交換層析純化和分子篩層析純化后,病毒滴度為1.0×1010TCID50/mL,兩步純化的回收率分別為30.8%和89.3%,總回收率為27.5%,對純化后的樣品進行PCR鑒定,結(jié)果表明基因未丟失。檢測260nm和280nm處吸光值OD260/OD280=1.25,符合純度要求。將發(fā)酵和純化后的重組腺病毒進行小鼠免疫實驗研究和安全性評價。研究結(jié)果表明,經(jīng)過兩步純化后的H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒疫苗能夠刺激機小鼠產(chǎn)生特異性抗體及細胞免疫應(yīng)答,且兩步純化疫苗組的細胞因子水平高于其他疫苗組。安全性評價試驗結(jié)果表明,兩步純化的H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒疫苗的安全性良好�？傊�,本實驗初步證明了生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)系統(tǒng)擴增的H5、H1亞型多表位流感重組腺病毒疫苗,經(jīng)陰離子交換層析和分子篩層析純化后,能使小鼠產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫,具有一定的保護性作用。
[Abstract]:Avian influenza virus (AIV) is a zoonotic pathogen of infectious diseases that affect all economic and human health problem worldwide. Most subtypes of avian influenza virus caused little or no waterfowl in poultry disease, but the outbreak of bird flu and high mortality. Although closely related to avian influenza virus rarely spread to humans, the virus after mutation or recombination has triggered life-threatening infection ability. New influenza virus strains continue to emerge, to predict its performance, communication, communication between the potential virulence or challenging people. Because it is difficult to predict what strains or what position mutation will cause the next influenza pandemic, it is to prepare in advance. Vaccination can play an effective preventive effect, so the research of new vaccines is particularly important. Influenza recombinant adenovirus vaccine can induce the humoral immune level And cellular immunity, and the recombinant adenovirus vector has good stability, high safety and wide host range and other advantages, has attracted much attention in recent years, with good prospects for development. The microcarrier bioreactor culture because of its large surface area, easy to carry out real-time detection and control of the cell, is widely used in vaccine production. Anion exchange chromatography has advantages of high sensitivity, good selectivity, separation speed, molecular sieve chromatography has the advantages of mild operating conditions, the separation effect of polymer material and so on, the two purification methods are commonly used. The laboratory was constructed with seasonal influenza H5 and influenza pandemic H1 type HA (HA1) gene mainly to avian influenza H1, H7 and H9 subtype HA Th antigen epitope and M1 epitope recombinant adenovirus vaccine expressing box. Through the 7L bioreactor culture system The system of H5, H1 subtype influenza multi epitope recombinant adenovirus were cultured in a fermentation product processing, chromatography and molecular sieve chromatography were purified by anion exchange, after correct identification, safety evaluation test. HEK-293 cell culture bioreactor, after several optimization test, determine the training parameters: temperature C: 37, pH:6.9: 30r/min, stirring rate, dissolved oxygen concentration: 50%, CO2: 5%. after 24h, more than 85% of adherent cells in microcarrier, 24-36h cells with high growth rate, 48h medium was changed, the total number of 84h cells increased 4 times, after the cell growth decreased. By using bioreactor culture a large number of techniques of H5 amplification, H1 subtype influenza multi epitope recombinant adenovirus, when HEK-293 cells were covered with micro 80-90% carrier surface, with 5MOI H5 vaccination, H1 subtype influenza multi epitope recombinant adenovirus, 48h after receiving treatment after disease poison, measured the titer of virus was 1. 0 * 1010TCID50/mL. by bioreactor culture of H5, the virus titer of H1 subtype influenza multi epitope recombinant adenovirus is 1 * 1010TCID50/mL, after screen chromatography anion exchange chromatography and molecular purification, the virus titer was 1 * 1010TCID50/mL, two step purification and recovery rate are 30.8% and 89.3%, the total recovery rate 27.5%, PCR to identify the purified samples, results showed that the gene was not lost. The detection of 260nm and 280nm absorption value of OD260/OD280=1.25, meet the requirements. The fermentation and the purity of purified recombinant adenovirus of mouse immune experiment research and safety evaluation. The results show that, after two step purification of H5 after H1. Subtypes of influenza multi epitope recombinant adenovirus vaccine can stimulate mice to produce antibody and machine specific cellular immune response, and the two step purification vaccine group and cytokine levels higher than the other group. The vaccine safety evaluation test The results show that the two step purification of H5 subtype H1 multi table safety flu recombinant adenovirus vaccine. In conclusion, this experiment demonstrated that bioreactor culture system was H5, H1 subtype influenza multi epitope recombinant adenovirus vaccine, chromatography and molecular sieve chromatography purified by anion after the exchange, the humoral and cell immunity, has a protective effect.

【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S859.5

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 陳志榮;A.M.Lew;;馬滅活腺病毒疫苗的研制和試驗初報[J];國外畜牧科技;1982年01期

2 宋紅肖;譚廣云;王春艷;張瑞興;朱乾琨;孫浩然;;小麥組蛋白H1基因保守序列原核載體的構(gòu)建及表達[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2010年01期

3 陳紅;徐春志;袁翠霞;白璧;方英;;2011-2013 年貴陽市 H5 亞型禽流感免疫狀況調(diào)查[J];當(dāng)代畜牧;2014年02期

4 尤向峰;;H5型禽流感診斷試劑對肉、種雞的免疫抗體效價比較[J];安徽農(nóng)學(xué)通報(上半月刊);2010年01期

5 李海燕;豬流感H1、H3亞型滅活疫苗[J];畜牧獸醫(yī)科技信息;2003年07期

6 屠宇平;禽流感A(H5)病毒的分離(中國香港)[J];疾病監(jiān)測;2002年07期

7 王麗萍;劉丹丹;閆小風(fēng);肖軍;肇瑩;楊濤;;耐鹽水稻品系H5和H6的耐鹽性研究[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2012年05期

相關(guān)會議論文 前4條

1 陳楓;陳莊;張紅;李萬平;;HBsAg重組腺病毒疫苗對小鼠的免疫應(yīng)答[A];第一屆全國疑難重型肝病大會、第四屆全國人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

2 馬春玲;姚X;周鋒;徐建;;SARS-CoV N基因重組DNA疫苗和腺病毒疫苗在BALB／c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)N蛋白特異的免疫應(yīng)答的初步研究[A];中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

3 魯會軍;譚磊;田明堯;張金雙;田宇飛;金擴世;金寧一;;H1、H3亞型流感病毒核酸疫苗構(gòu)建及鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會第二次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 譚磊;張丹;魯會軍;田明堯;田宇飛;金擴世;金寧一;;H1、H3亞型豬流感病毒核酸疫苗構(gòu)建及鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 本報記者 楊成德;努力把恰卜恰H1高原汽車越野挑戰(zhàn)賽打造成全國知名賽事[N];海南報;2012年

2 基因潮;美國默克公司進行預(yù)防HIV的臨床試驗[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 劉威岑;基于RCF算法的表位研究及一株鼠疫中和抗體表位鑒定[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2017年

2 張志榜;PRRSV Nsp10線性B細胞表位的鑒定及Nsp10a亞型產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 羅保君;漢灘病毒重組腺病毒疫苗的基礎(chǔ)研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

4 李濱;幽門螺桿菌表位特異性CD4+T細胞免疫保護機制及CD8+T細胞應(yīng)答特征研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2017年

5 侯建梅;巨噬細胞炎癥蛋白3β（Mip3β）重組腺病毒疫苗抗腫瘤實驗研究[D];四川大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張萍;H5、H1亞型多表位重組腺病毒疫苗的制備及安全性評價研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

2 柴忠華;H1/H5亞型流感重組腺病毒疫苗的制備工藝及安全性評價研究[D];長春中醫(yī)藥大學(xué);2015年

3 曹亮;歐洲型PRRSV重組腺病毒疫苗構(gòu)建及實驗免疫研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

4 王鋒;濾泡輔助性T細胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中的作用研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2013年

5 李晉文;猴B病毒血清學(xué)檢測方法的比較及表位研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2017年

6 宋瑞雪;豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白B細胞表位的預(yù)測及鑒定[D];鄭州大學(xué);2017年

7 任小鳳;豫西H1事件高分辨率氣候變化的多指標(biāo)石筍記錄及洞穴監(jiān)測研究[D];西南大學(xué);2015年

8 李林怡;媒介情景理論視角下微信朋友圈H5廣告頁面異化問題研究[D];鄭州大學(xué);2016年

9 馮穎;人14型和55型腺病毒中和抗體表位分析[D];廣州醫(yī)科大學(xué);2017年

10 楊丹;結(jié)核分枝桿菌潛伏相關(guān)抗原Rv2657c表位預(yù)測、重組蛋白制備及其免疫學(xué)特性的初步研究[D];河北北方學(xué)院;2017年

，

本文編號：1694489