本文選題：CDV　切入點(diǎn)：分子流行病學(xué)調(diào)查　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：2015年6月至2016年6月,對(duì)山東省中東部地區(qū)送檢的118份病死水貂、貉子和狐貍肺臟病料檢測(cè),水貂83份、貉子17份、狐貍18份。根據(jù)Genbank已發(fā)表犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)N基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,建立了其RT-PCR檢測(cè)方法,陽(yáng)性結(jié)果為71份、13份與13份,陽(yáng)性率為85.54%、76.47%與72.22%。選取部分陽(yáng)性病料經(jīng)MDCK細(xì)胞分離,貂源分離獲得4株CDV,貉源分離1株,狐源沒(méi)有分離得到,5株分離株分別命名為CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2與CDV LC2株。接種細(xì)胞后部分樣品呈現(xiàn)明顯CPE亦有部分樣品無(wú)明顯CPE,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)部分無(wú)CPE細(xì)胞凍融液檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性,表明CDV對(duì)MDCK細(xì)胞的適應(yīng)性有所不同。根據(jù)Genbank已發(fā)表的CDV F、H與N全基因序列分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增F、H與N全基因的特異性引物,研究CDV分子生物學(xué)特性。采用RT-PCR擴(kuò)增及瓊脂凝膠回收、克隆,對(duì)克隆純化獲得的相關(guān)片段測(cè)序與分析。經(jīng)DNAstar軟件對(duì)分離株核苷酸與氨基酸序列分析,根據(jù)Genbank中已發(fā)表的犬瘟熱毒株作參考株,構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。H基因核苷酸序列分析結(jié)果:CDV103、C DV114、CDV122、CDVDH2與CDVLC2株彼此同源性為90.7%-100.0%,CDVLC2與CDVDH2株的同源性最高100.0%,CDVLC2、CDVDH2株與CDV103、CDV114、CD V122株彼此間有相對(duì)較高同源性為90.7%-91.1%。H蛋白氨基酸序列潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果:CDV103、CDV114與CDV122株糖基化位點(diǎn)均為9個(gè);第309-311位糖基化位點(diǎn)為野毒株所獨(dú)有得,Asia-1型中部分毒株具有9個(gè)潛在N-聯(lián)糖基化位點(diǎn),CDVDH2與CDVLC2毒株糖基化位點(diǎn)位7個(gè),這與Convac弱毒疫苗株H蛋白氨基酸序列的糖基化位點(diǎn)一致。H基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果:CDV103、CDV114與CDV122株屬于Asia-1型,與JN(08)(2009ChinaFJ810213fox)株有較近親緣關(guān)系;CD VDH2與CDVLC2分離株屬于America-1型,與Convac、Onderstepoort疫苗株關(guān)系較近。F基因核苷酸序列分析結(jié)果:CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2與CDVLC2株核苷酸序列同源性為90.3%-99.0%,CDV103、CDV114與CDV122株同Onderstepoort疫苗株同源性為90.4%-90.7%,CDVDH2、CDVLC2株與Onderstepoort疫苗株同源性最高為99.0%。Fsp推導(dǎo)氨基酸序列潛在N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果:CDV103、CDV114與CDV122株均含有2個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn),位于第62位和108位,CDV103、CDV114與CDV122株糖基化位與Asia-1型毒株一致。F基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果:5株CDV劃分于2個(gè)基因型,CDV103、CDV114與CDV122株屬于Asia-1型,與ZYL(2016ChinaKX499865fox)株存在較近親緣關(guān)系;CDVDH2與CDVLC2株屬于America-1型,同Onderstepoort疫苗株關(guān)系較近。N基因核苷酸序列分析結(jié)果:CDV103、CDV114、CDV122、CDVDH2與CDVLC2株彼此間同源性均高于99.5%,為99.5%-100.0%,CDV103與CDV114株相似性最高為100.0%,CDVLC2與CDVDH2株同源性最低為99.5%。N蛋白氨基酸序列存在較高同源性,5株分離株彼此同源性為99.0%-100.0%。與Onderstepoort弱毒疫苗株相似性較高,為98.3%-98.9%;N基因遺傳進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果:5株分離株與Onderstepoort疫苗株存在較近親緣關(guān)系,劃分于America-1型。本研究對(duì)山東省中東部地區(qū)毛皮動(dòng)物犬瘟熱病毒流行病學(xué)調(diào)查,分離鑒定,主要基因測(cè)序,構(gòu)建遺傳進(jìn)化發(fā)生樹(shù)。本研究主要克服犬瘟熱病毒分離困難的問(wèn)題,總結(jié)犬瘟熱病毒分離過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)。為做好犬瘟熱病毒防制和監(jiān)測(cè)等相關(guān)工作提供了重要的分子流行病學(xué)資料。為犬瘟熱病毒分子生物學(xué)提供了最新的調(diào)查數(shù)據(jù)。
[Abstract]:From June 2015 to June 2016, 118 copies of mink for inspection of Shandong Province in the eastern region, and the fox raccoon lung disease material detection, 83 copies of 17 copies of mink, raccoon, fox 18. According to the published Genbank of canine distemper virus (Canine distemper virus, CDV) N gene is highly conserved region primers were designed and established the RT-PCR detection methods, positive results for 71 copies, 13 copies and 13 copies, the positive rate was 85.54%, 76.47% and 72.22%. were part of a positive disease after MDCK cells were isolated, 4 strains of CDV isolated from mink source, 1 strains of raccoon dog, fox source is not isolated, 5 strains of isolates were named as CDV103 and CDV114. CDV122, CDVDH2 and CDV LC2 strains. After inoculation samples showed no obvious CPE is also part of the sample CPE, RT-PCR analysis found no CPE cell lysate was tested positive, showed that the adaptability of CDV on MDCK cells were different. According to the Genbank CDV: F, H and N were designed to amplify the gene sequence of F, specific primers H and N genes, characteristics of molecular biology of CDV. Amplified and cloned by RT-PCR agar gel recovery, purification, sequencing and analysis of related fragments obtained by DNAstar software. Cloning of isolates of nucleotide and amino acid sequence analysis according to the published Genbank, the canine distemper virus strains were reference strains, phylogenetic tree construction analysis of nucleotide sequences of.H gene: CDV103, C DV114, CDV122, CDVDH2 and CDVLC2 strains of each homology was 90.7%-100.0%, the highest homology of 100%, CDVLC2 and CDVDH2 CDVLC2 strain, CDVDH2 strain and CDV103, CDV114, CD among the V122 strains have a relatively high homology of amino acid sequence of 90.7%-91.1%.H protein N- potential glycosylation site analysis results: CDV103, CDV114 and CDV122 strains of glycosylation sites were 9; the 309-311 glycosylation sites Unique to wild strains of type Asia-1 strains have 9 potential glycosylation sites of N-, CDVDH2 and CDVLC2 strains of glycosylation site 7, which with Convac attenuated vaccine strain H protein amino acid sequence genetic glycosylation sites consistent.H gene phylogenetic analysis results: CDV103 and CDV114. CDV122 strains belonged to Asia-1 type, and JN (08) (2009ChinaFJ810213fox) strains have a close genetic relationship; CD VDH2 and CDVLC2 isolates belong to type America-1, Convac and Onderstepoort, the closer relationship between vaccine strain.F gene nucleotide sequence analysis results: CDV103, CDV114, CDV122, CDVDH2 and CDVLC2 strains of nucleotide sequence homology of 90.3%-99.0%. CDV103, CDV114 and CDV122 strains with Onderstepoort vaccine strain homology to 90.4%-90.7%, CDVDH2, CDVLC2 strain and Onderstepoort vaccine strain had the highest homology to the deduced amino acid sequence of 99.0%.Fsp N- potential glycosylation site analysis results: CDV103, CD V114 and CDV122 strains contained 2 potential N- linked glycosylation sites, located in sixty-second and 108, CDV103, construction of phylogenetic analysis results of glycosylation and the Asia-1 strain.F gene CDV114 and CDV122 strains, 5 CDV strains into 2 genotypes, CDV103, CDV114 and CDV122 strains belong to type Asia-1, and ZYL (2016ChinaKX499865fox) strains had a close genetic relationship; CDVDH2 and CDVLC2 belonged to America-1 type, with Onderstepoort vaccine strain is closely related to the.N gene nucleotide sequence analysis results: CDV103, CDV114, CDV122, CDVDH2 and CDVLC2 strains of each homology were higher than 99.5%, 99.5%-100.0%, CDV103 and CDV114 strain the highest is 100%, CDVLC2 and CDVDH2 were the lowest homology to the amino acid sequence of 99.5%.N protein has high homology, 5 isolates each homology was 99.0%-100.0%. and Onderstepoort attenuated vaccine strain of high similarity to 98.3%-98.9%; N Phylogenetic tree analysis results: 5 isolates and Onderstepoort vaccine strain has close relationship, divided in America-1. The research on the epidemiology of canine distemper virus fur animal in middle part of Shandong province mainly investigation, isolation and identification, gene sequencing, genetic construction of a phylogenetic tree. This research is mainly to overcome the difficulty in separation of canine distemper virus isolation of canine distemper virus, summarize the experience in the process. Provide important data for the molecular epidemiology of canine distemper virus prevention and monitoring and other related work. The molecular biology of canine distemper virus provides the latest survey data.

【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1686913