本文選題：雞　切入點：PGCs　出處：《揚州大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：生殖細胞可以把生物的遺傳信息傳遞給下一代,維持生命的傳遞,對生殖細胞分化研究具有重要意義。原始生殖細胞(Primordial germ cells,PGCs)是所有生殖細胞的始祖細胞,能夠在性腺中分化為精原干細胞(Sperrmatogonial stem cells,SSCs)或卵原干細胞(Ovary stem cells,OSCs),進而進一步發(fā)育分化為精子或卵子。PGCs的發(fā)生受到許多內(nèi)源性調(diào)控因子和細胞外基質(zhì)等外源因素的調(diào)控,這些因子通過不同的信號通路,構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),直接或間接地調(diào)控PGCs的形成。目前,研究者們通過體外分離培養(yǎng)、體外誘導(dǎo)、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細胞等方多種方式對PGCs的生長和分化進行了大量的研究,然而關(guān)于調(diào)控PGCs發(fā)生過程的具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機制卻知之甚少,因此PGCs發(fā)生過程機制的探究成為近年來備受關(guān)注的焦點。隨著PGCs研究的深入,研究者們已經(jīng)探究發(fā)現(xiàn)存在一些關(guān)鍵性的基因、信號通路、生長因子以及表觀遺傳修飾因素在此過程中起到重要的調(diào)控作用,隨著這些因素對于PGCs發(fā)生起到了一定的促進作用,但是并沒有真正從意義上提供提高PGCs生成效率,進而無法滿足相關(guān)的科研需求,因此亟需對從新的領(lǐng)域?qū)GCs的生成機制進行創(chuàng)新性地探究,深入了解和認識PGCs的產(chǎn)生過程,從而獲取大量的PGCs。為了進一步探究調(diào)控PGCs發(fā)生及分化的作用機制,從根本上解決PGCs生成效率低下的問題,本研究基于本實驗室前期對雞胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)、PGCs和SSCs的RNA-Seq測序結(jié)果中篩選到PGCs特異表達的新基因LOC418414(Genbank登錄號:XM_416629.3)的基礎(chǔ)上,根據(jù)其表達位置命名為C1EIP,對其在雞ESCs向PGCs分化過程中從體內(nèi)和體外兩個水平上進行系統(tǒng)的功能和機制驗證,深入了解家雞ESCs向PGCs分化過程的調(diào)控機制,為有效提高ESCs向PGCs誘導(dǎo)分化效率提供理論依據(jù)和參考,并且為雞ESCs向PGCs分化其他類似關(guān)鍵功能基因的功能及機制研究提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.為了有效確定候選特異基因C1EIP在的生物功能以及其真核細胞中的定位,為后期功能及機制研究奠定基礎(chǔ),對C1EIP進行生物信息學(xué)分析顯示,C1EIP主要與鳥類同源性較高,但同源蛋白為未知蛋白,未發(fā)現(xiàn)特異的結(jié)構(gòu)域。我們結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫提供的C1EIP編碼序列,利用RT-PCR擴增C1EIP編碼區(qū),分別構(gòu)建重組表達載體pEGFP-C1EIP 和 pcDNA3.0-C1EIP。以 pEGFP-C1EIP 和 pcDNA3.0-C1EIP 轉(zhuǎn)染 DF1 細胞,確定C1EIP的定位,并以RT-PCR和Western Blot檢測C1EIP在真核細胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的情況;同時以PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP載體,肌肉注射小鼠后采血制備抗小鼠血清,以IFA和Western Blot檢測抗體效價。酶切及測序結(jié)果均顯示pEGFP-C1EIP和pcDNA3.0-C1EIP載體構(gòu)建成功。pEGFP-C1EIP轉(zhuǎn)染DF1細胞后,C1EIP表達于細胞質(zhì)中,說明C1EIP定位于細胞質(zhì)中,且能夠啟動轉(zhuǎn)錄和翻譯;以1μg:1.5μg的比例將PEI包裹pcDNA3.0-C1EIP產(chǎn)物注射小鼠肌肉制備抗小鼠血清,IFA檢測最佳效價為1:25,并以此效價進行Westen Blot檢測顯示能夠識別到C1EIP蛋白。2.為了探究C1EIP在雞PGCs生成過程中生物學(xué)功能探究,我們針對C1EIP編碼區(qū)設(shè)計3個shRNA靶位點和1個陰性對照位點,構(gòu)建慢病毒干擾載體,并進行慢病毒包裹,以qRT-PCR檢測慢病毒干擾載體的干擾效率。在體外,以慢病毒干擾載體和過表達載體分別轉(zhuǎn)染2代ESCs細胞,結(jié)合RA誘導(dǎo)劑誘導(dǎo),觀察ESCs形態(tài)變化,并以qRT-PCR、細胞免疫化學(xué)和流式細胞分析檢測PGCs生成效率;在體內(nèi),以慢病毒RNA干擾載體侵染雞胚,摸索出最佳的侵染效率,侵染后的雞胚以qRT-PCR、PAS切片染色、免疫組化以及流式細胞分析等方法檢測PGCs生成效率。結(jié)果顯示成功構(gòu)建慢病毒干擾載體C1EIP-shl、C1EIP-sh2 和 C1EIP-sh3,干擾效率分別為 80.39%、87.80%和 38.36%。在體外,正常RA誘導(dǎo)在第2d出現(xiàn)小類胚體(Embryoid Body,EB),在第4d時類胚體增多、變大,第6d類胚體的邊緣開始出現(xiàn)裂口,并且伴隨有少量的細胞從類胚體內(nèi)部釋放,第8d時類胚體嚴重破裂,大量細胞釋放,在第10-12d類胚體基本上裂解完全,出現(xiàn)類精原干細胞(Spermatogonial stem cells-like,SSCs-like),并聚團成葡萄串狀克隆;過表達組中,在第2d出現(xiàn)大的類胚體,第4d類胚體邊緣開始出現(xiàn)小缺口,第6d類胚體大部分破裂并釋放大量內(nèi)部細胞,第8d出現(xiàn)類SSCs細胞,第10-12d出現(xiàn)典型的呈葡萄串狀的SSCs克隆;在敲低中,第2-6d細胞未出現(xiàn)類胚體,第8d開始出現(xiàn)小的類胚體,然而培養(yǎng)至12d類胚體的數(shù)量、大小以及形態(tài)并未出現(xiàn)明顯的變化;qRT-PCR結(jié)果顯示過表達C1EIP后,全能性基因sox2表達量總體上由1.00±0.04持續(xù)降低至0.14±0.01,而cvh、c-kit、Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1表達量自始至終都逐步上升至2.14±0.03、2.79±0.05、2.26±0.06、2.73±0.03 和 2.59±0.05,目的基因 C1EIPP 表達量在第 4d 上升至3.99±0.06,在第12d時由下降至2.87±0.07;敲低C1EIP后,sox2表達量在第0-12d中沒有顯著的變化,cvh、c-kit和C1EIP表達量分別由1.00±0.02、1.00±0.01和1.00±0.02穩(wěn)定持續(xù)下降至 0.55±0.01、0.70±0.01 和 2.87±0.07,Stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1表達量由 1.00±0.04、1.00±0.04、1.00±0.03 和 1.00±0.04 分別先下降至 0.53±0.04、0.45±0.05、0.86±0.03 和 0.76±0.02,然后再略微上升至 0.59±0.01、0.80±0.04、0.88±0.04、0.93±0.08;細胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示相對于RA誘導(dǎo)組,過表達組顯著增加CVH和C-KIT的表達,而敲低組抑制CVH和C-KIT的表達。流式細胞分析結(jié)果顯示,RA誘導(dǎo)組中CVH+細胞比例為3.4%,在過表達C1EIP后,CVH+細胞比例顯著上調(diào)至4.6%,然而敲低C1EIP使得CVH+細胞降低至2.9%。在體內(nèi),雞胚注射慢病毒載體的最佳條件為鈍端注射10μL 106TU/mL慢病毒干擾載體+90μL DMEM,注射后能夠穩(wěn)定表達egfp且雞胚能夠激發(fā)綠色熒光。qRT-PCR結(jié)果顯示各個基因的表達量在Blank組和sh-Ctrl組之間沒有顯著的變化,而在敲低C1EIP后,全能性基因sox2的表達量下降趨勢相對于其他分組有所減緩,而cvh、c-kit、stra8、Dazl、integrin α6和integrin β1等生殖相關(guān)基因以及目的基因C1EIP的大幅度下降到0.20±0.07、0.43±0.08、0.45±0.06、0.51±0.07、0.35±0.07、0.46±0.04和0.22±0.03;PAS結(jié)果顯示敲低C1EIP能夠顯著降低PGCs的產(chǎn)生。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示空白組和陰性對照組中生殖嵴中高度表達CVH和C-KIT,且表達部位幾乎充滿整個生殖嵴中,然而在敲低組中,CVH和C-KIT蛋白表達明顯降低,并且表達的部位僅僅局限于生殖嵴的邊緣部分。流式細胞分選結(jié)果顯示,相對于空白組和對照組(4.6%和4.3%),敲低C1EIP使得CVH標記的PGCs比例明顯下調(diào)至3.1%。3.為了系統(tǒng)有效地闡明C1EIP表達的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控機制,我們結(jié)合NCBI和UCSC數(shù)據(jù)庫中查詢C1EIP轉(zhuǎn)錄起始位點上游啟動子2000bp左右的序列,擴增C1EIP啟動子長片段,克隆至pEGFP-N1載體中,置換CMV啟動子,構(gòu)建重組表達載體pC1EIP-EGFP,轉(zhuǎn)染至DF1細胞中檢測C1EIP啟動子長片段的啟動活性;通過缺失片段克隆技術(shù),構(gòu)建C1EIP啟動子不同缺失片段載體PGL3-P1～PGL3-P10,轉(zhuǎn)染DF1細胞后以雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測各個缺失片段的啟動子活性,篩查出C1EIP啟動子核心調(diào)控區(qū)域;在此區(qū)域以生物信息學(xué)預(yù)測關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,并對各個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點分別進行定點缺失,構(gòu)建缺失載體,同樣以雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點缺失對啟動子活性的影響;最后分別 10μmol/L、1μmol/L 和 4mmol/L 的 5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Azadc)、Trichostatin A(TSA)和 valproic acid(VPA)處理,檢測 DNA 甲基化和組蛋白乙�；瘜1EIP啟動子活性以及C1EIP在ESCs、PGCs和SSCs中表達變化的影響。酶切及測序結(jié)果均表明pC1EIP-EGFP構(gòu)建正確,轉(zhuǎn)染DF1細胞后能夠激發(fā)綠色熒光,定性地說明擴增的C1EIP啟動子長片段具有啟動活性;同時啟動子各個缺失片段載體酶切和測序結(jié)果也表明載體構(gòu)建成功,雙熒光素酶檢測啟動子活性結(jié)果顯示P4-P6間,即-1025～-912bp為C1EIP啟動子的核心活性區(qū)域;在此區(qū)域內(nèi)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點包括MEISS1、MAFG::NFE2L1、STAT3、HLTF和Hand1::Tcf3 其中只有STAT3起到正向調(diào)控作用;最后發(fā)現(xiàn)在DNA甲基化抑制5-Azadc以及組蛋白乙�；种苿㏕SA和VPA處理后,C1EIP 啟動子活性由 10.82±0.54 上升至 18.49±0.72、33.27±0.83 和 38.11±0.53,同時5-Azadc、TSA和VPA處理后,C1EIP在雞ESCs、PGCs和SSCs中表達量分別由1.00±0.23、5.73±0.54、0.94±0.23 變化為 1.43±0.42、10.60±0.26、2.83±0.18 和2.64±0.23、9.89±0.37、3.25±0.16 以及 2.99±0.43、8.33±0.56、2.94±0.29。4.為了探究C1EIP調(diào)控PGCs生成的機制,我們通過構(gòu)建C1EIP原核表達載體,誘導(dǎo)其在大腸桿菌中表達,以GST pull-down挖掘C1EIP互作蛋白,構(gòu)建融合表達載體pcDNA3.0-ENO1-HA,以體外免疫共沉淀技術(shù)驗證ENO-HA和C1EIP-EGFP間互作關(guān)系。結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫,以生物信息學(xué)分析技術(shù)探究互作基因ENO1的關(guān)聯(lián)基因,以qRT-PCR驗證其在PGCs生成過程中的表達變化情況。通過構(gòu)建Myc啟動子的雙熒光素酶報告載體PGL3-Myc-pro以及重組表達載體pcDNA3.0-MBP-1,同時為了消除同源家族基因的干擾,我們還構(gòu)建了ENO2的重組表達載體pcDNA3.0-ENO2,結(jié)合之前構(gòu)建完成的pcDNA3.0-ENO1-HA載體,共轉(zhuǎn)染DF1細胞,以雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測Myc啟動子活性變化情況,并根據(jù)所得結(jié)果和查找相關(guān)文獻,繪制出C1EIP和ENO1/MBP-1互作介導(dǎo)Notch信號通路調(diào)控PGCs生成的模式圖。GST pull-down結(jié)果顯示C1EIP與ENO1之間存在互作,且體外免疫共沉淀驗證C1EIP之與ENO1間的互作關(guān)系。通過Uniport和PSORT Ⅱ數(shù)據(jù)庫以及共表達網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)ENO1定位于細胞質(zhì)中,與Myc相互關(guān)聯(lián),Myc下游基因為Notch1。qRT-PCR結(jié)果顯示C1EIP和ENO1在雞ESCs向SSCs分化過程中表達趨勢保持一致,并且與Myc和Noth1表達趨勢相反。酶切和測序結(jié)果顯示雙熒光素酶報告載體PGL3-Myc-pro以及重組表達載體pcDNA3.0-MBP-1和pcDNA3.0-ENO2均構(gòu)建成功,且雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示MBP-1對Myc啟動子活性存在抑制作用,而ENO1和ENO2對其沒有影響。最后根據(jù)以上結(jié)果和相關(guān)文獻報道繪制C1EIP和MBP-1互作介導(dǎo)Notch信號通路調(diào)控PGCs生成的模式圖,結(jié)果顯示C1EIP可能作為錨定蛋白將ENO1蛋白固定于細胞質(zhì)中,當ENO1發(fā)生磷酸化或去磷酸化后,C1EIP將其釋放,并易位入核,在易位過程中丟失前面96個氨基酸殘基,形成MBP-1蛋白,從而結(jié)合至Myc啟動子,抑制其轉(zhuǎn)錄,進而阻斷Notch信號通路的信號傳導(dǎo),最終反向促進雞ESCs向PGCs方向分化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S831

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本文編號：1664244