本文選題：副豬嗜血桿菌　切入點：神經(jīng)氨酸酶NanH　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學》2015年碩士論文

【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)屬于革蘭氏陰性菌,是豬群上呼吸道的條件性致病菌。本研究主要以副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶Nan H與自轉(zhuǎn)運蛋白AT1為研究對象,探究其在副豬嗜血桿菌致病過程中發(fā)揮的主要功能。本課題取得的主要研究成果如下所示:1.副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶驗證對菌株JS0135,缺失株JS0135Δnan H::kan(以下簡稱Δnan H)和互補菌株JS0135-Cnan H(以下簡稱Cnan H)進行神經(jīng)氨酸酶活性檢測,檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),互補菌株Cnan H的神經(jīng)氨酸酶活性與缺失菌株相同,極顯著低于野生菌株。后對其進行粘附實驗,發(fā)現(xiàn)互補菌株Cnan H的粘附能力仍與缺失株相同,與野生株差異顯著,因此該互補菌株并沒有互補成功,缺失株構(gòu)建成功。生長曲線測定發(fā)現(xiàn),野生菌株與缺失株之間無顯著性差異,且菌株在體外生長過程中不需要唾液酸提供營養(yǎng)。2.JS0135-Δnan H菌株的粘附能力、血清抗性和氧化耐受能力改變將菌株JS0135,Δnan H與豬腎上皮細胞(PK-15)與豬髖動脈內(nèi)皮細胞(PIEC)互作,發(fā)現(xiàn)缺失株Δnan H的粘附能力比野生菌株JS0135強。與健康豬血清互作,發(fā)現(xiàn)缺失了nan H基因后,菌株的血清抗性降低。補體激活的經(jīng)典途徑在對菌株的殺傷中發(fā)揮一定作用。進行補體沉降實驗則發(fā)現(xiàn),在缺失株Δnan H表面沉積的補體要高于野生株JS0135。Western blot則發(fā)現(xiàn)菌株表面沉積的成分中存在Ig G蛋白。質(zhì)譜分析則發(fā)現(xiàn)在菌株表面有C3分子沉積,并通過Western blot得到驗證,且通過流式實驗發(fā)現(xiàn)在缺失株表面沉積的補體C3要高于野生株。進行氧化耐受能力實驗,發(fā)現(xiàn)缺失神經(jīng)氨酸酶nan H基因后細菌的氧化耐受能力降低,從而發(fā)現(xiàn)nan H基因在菌株氧化耐受中發(fā)揮的重要作用。3.副豬嗜血桿菌自轉(zhuǎn)蛋白at1基因缺失株的構(gòu)建及其功能研究通過自然轉(zhuǎn)化方法在JS0135中構(gòu)建了at1基因缺失株JS0135Δat1::kan,以下簡稱(Δat1)。通過對PK-15細胞毒性實驗,發(fā)現(xiàn)at1基因無細胞毒性作用。細菌的粘附實驗表明at1基因缺失后,菌株對PK-15細胞的粘附能力增強;同時發(fā)現(xiàn)at1基因缺失后對細菌生物被膜形成以及自身凝集都沒有影響。同時發(fā)現(xiàn),缺失了at1基因后細菌的氧化耐受能力減弱,表明at1基因可能與細菌的氧化耐受能力有關。綜合以上研究結(jié)果,唾液酸酶在副豬嗜血桿菌的致病機制中可能發(fā)揮重要作用,其通過減少細菌表面沉積的補體分子增強細菌對血清的抵抗作用。同時通過增強菌株的氧化耐受能力感染并侵入宿主。自轉(zhuǎn)運蛋白AT1也具有增強細菌氧化耐受的功能。
[Abstract]:Haemophilus parasuis (Haemophilus parasuis) belongs to Gram-negative bacteria and is a conditional pathogen in the upper respiratory tract of swine population. This study focused on the neuraminidase Nan H and AT1 of Haemophilus parasuis. The main results of this study are as follows: 1. The neuraminidase test of Haemophilus parasuis strain JS0135, the missing strain JS0135 螖 nan H: kanand (螖 nan H) and the interaction between the two strains were investigated. The main results of this study are as follows: 1. The neuraminidase of Haemophilus parasuis strain JS0135, the missing strain JS0135 螖 nan H: K 謾 n (螖 nan H) and each other. The neuraminidase activity of JS0135-Cnan H (hereinafter referred to as Cnan H) was detected. The results showed that the neuraminidase activity of the complementary strain Cnan H was the same as that of the deficient strain, and was significantly lower than that of the wild strain. The adhesion of the complementary strain Cnan H was still the same as that of the missing strain. The difference between the strain and the wild strain was significant, so the complementary strain was not successful and the missing strain was successfully constructed. The growth curve showed that there was no significant difference between the wild strain and the missing strain. The strain did not need sialic acid to provide nutrition. 2. JS0135- 螖 nan H did not need to provide nutrition in vitro. Serum resistance and oxidative tolerance of strain JS0135, 螖 nan H interacted with porcine renal epithelial cells (PK-15) and porcine hip artery endothelial cells (PIECs). It was found that the adhesion ability of deletion strain 螖 nan H was stronger than that of wild strain JS0135. After interaction with healthy pig serum, the deletion of nan H gene was found. The classical pathway of complement activation played a certain role in killing the strain. The complement deposited on the surface of the missing strain 螖 nan H was higher than that of the wild strain JS0135.Western blot, and the IgG G protein was found in the component deposited on the surface of the strain, and the C3 molecule deposition was found on the surface of the strain by mass spectrometry, which was verified by Western blot. The results of flow test showed that the complement C3 deposited on the surface of the missing strain was higher than that of the wild strain, and the oxidative tolerance ability of bacteria was decreased after the deletion of nan H gene of neuraminidase. It was found that nan H gene plays an important role in the oxidative tolerance of the strain .3.The construction and function of the at1 gene deletion strain of Haemophilus parasuis autotropin were constructed in JS0135 by natural transformation method. The at1 gene deletion strain JS0135 螖 at 1: 1: kan. was constructed by natural transformation. Through the cytotoxicity test of PK-15 cells, It was found that at1 gene had no cytotoxicity. Bacterial adhesion test showed that the adhesion ability of the strain to PK-15 cells was enhanced after at1 gene deletion. It was also found that the absence of at1 gene had no effect on bacterial biofilm formation and self-agglutination. At the same time, the ability of bacterial oxidative tolerance was decreased after the deletion of at1 gene. These results suggest that sialidase may play an important role in the pathogenesis of Haemophilus parais. It enhances the bacterial resistance to serum by reducing the complement molecules deposited on the bacterial surface, and infects and invades the host by enhancing the ability of bacterial oxidation tolerance. The self-transporter AT1 also has the function of enhancing bacterial oxidative tolerance.
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

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本文編號：1654084